Chapitre 13 - données nouvelles en infectiologie : l'apport de la biologie moléculaire

APPORT DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE POUR LA PATHOLOGIE INFECTIEUSE DANS L'INFERTILITE FEMININE ET MASCULINE

A. AUDEBERT*

IGF1, 35, rue Turenne, 33000 Bordeaux.

INTRODUCTION

Tant chez la femme que chez l'homme, l'infection représente une cause majeure de stérilité ou d'hypofertilité ; les maladies sexuellement transmissibles affectent principalement la fertilité par l'atteinte des parties hautes du tractus génital, d'autres mécanismes ont aussi été proposés.

Si ces conséquences néfastes de l'infection sont connues depuis de nombreuses années, la nature des agents infectieux en cause a changé notablement dans les pays industrialisés : aujourd'hui les principaux agents sont chlamydia trachomatis (CT) chez la femme et CT et Ureaplasma uréalyticum (UU) chez l'homme ; les infections impliquant le gonocoque sont elles devenues beaucoup plus rares aujourd'hui dans ces pays.

L'une des particularités des infections liées à ces germes est la fréquence des formes cliniquement silencieuses, tout autant capables d'affecter la fertilité que les formes les plus bruyantes. C'est dire que le dépistage avec l'identification des porteurs est une mesure essentielle de prévention, seule capable de réduire la fréquence de ces infections et leurs conséquences.

Le diagnostic actuel repose essentiellement soit :

- sur la mise en évidence des agents sur des prélèvements effectués à différents niveaux du tractus génital ; ils imposent une culture plus ou moins facile et plus ou moins lente selon l'agent, une méthode de détection (détection par exemple antigénique) et une concentration minimale ; l'identification et la caractérisation sont ensuite réalisées en faisant appel à différentes propriétés biochimiques ou antigéniques ; ces techniques sont simples et rapides mais peu sensibles ;

- soit sur la sérologie, qui ne permet qu'un diagnostic tardif et qui s'avère peu sensible.

La biologie moléculaire a permis la connaissance de la structure et des fonctions des acides nucléiques et des protéines. Les applications des techniques de biologie moléculaire dans le diagnostic bactériologique se sont surtout développées au cours de ces dernières années avec, d'une part la disponibilité d'outils performants, et d'autre part la connaissance des séquences spécifiques des génomes bactériens. En théorie un large éventail d'agents infectieux peuvent être détectés par ces techniques si l'on connaît au moins une partie de leurs séquences, mais peu de systèmes sont encore commercialisés, et en pratique, dans le domaine que nous envisageons, chlamydia trachomatis est celui pour lequel les applications immédiates sont les plus avancées. Etant donné son rôle prédominant dans les infections génitales, l'essentiel de cette brève revue lui sera consacrée, d'autant plus que quelques études ont déjà été publiées.

CHLAMYDIOSE FEMININE ET FERTILITE

On n'a réellement pris la mesure du rôle de CT dans les infections génitales féminines qu'au cours de ces 25 dernières années [1].

CT est transmis sexuellement et dans un premier temps atteint les voies génitales basses ; c'est à ce stade qu'il faut le dépister de manière systématique, chez toutes les femmes asymptomatiques de moins de 25 ans (en particulier lors de toute consultation pour une demande de contraception), ce qui permettrait d'appréhender 70 % de l'épidémie [2] ; une telle politique a permis en Suède de réduire le portage cervical chez les jeunes qui est passé de 25 % à 2 % et celui de la population générale de 5 à 0,5 % [1].

En France, selon les Centres de Planification Familiale où le dépistage des MST est pratiqué, les taux d'identification de CT varient de 18 % à 27 % en fonction de l'âge et de la méthode diagnostique utilisée : l'épidémie chlamydienne, propagée par les sujets porteurs, n'a donc pas diminué, contrairement à ce qui a été observé dans les pays scandinaves où le dépistage est plus intensif. Les prélèvements doivent porter sur le col et l'urètre.

L'atteinte des voies génitales hautes se fait par progression de CT au niveau de l'endomètre puis au niveau de la muqueuse tubaire ; elle peut se traduire par une salpingite aiguë (avec souvent dans ces cas l'association à d'autres germes) mais aussi et surtout de manière parfaitement silencieuse et sournoise ; elle est accompagnée d'une positivité de la sérologie.

Les formes silencieuses n'ont été reconnues que plus récemment [3] ; dans notre expérience de la chirurgie tubaire percoelioscopique pour hydrosalpinx, on ne retrouve un antécédent susceptible d'expliquer l'atteinte tubaire distale que chez seulement près de 50 % des patientes et 66 % des patientes ont une sérologie positive à CT [4] ; les résultats obtenus sont d'ailleurs corrélés à la positivité, ils sont d'autant plus mauvais que la sérologie est positive et en cas de conception le taux de grossesse ectopique est très élevé [4].

Expérimentalement il a été démontré que CT était capable de léser la trompe et de causer des altérations irréversibles conduisant à l'hypofertilité voire à la stérilité mais aussi d'augmenter considérablement le risque de grossesse ectopique. CT peut être bloqué par la réaction inflammatoire à l'intérieur des cellules sous forme de corps élémentaires ne se reproduisant plus, mais entretenant une réaction inflammatoire de l'organisme [3] ; cela met en jeu des protéines de surface ou protéines de choc thermique (" Heat Schock Protein ") responsables d'une hypersensibilité retardée avec sécrétion permanente de fibrine et poursuite de l'altération tubaire.

Contrairement à la forme aiguë, qui guérit dans 80 % des cas après traitement, la forme chronique ne répond que de manière très inconstante [5]. C'est dire une nouvelle fois l'importance de découvrir et de traiter les chlamydioses quand elles sont encore uniquement localisées au niveau des parties basses des voies génitales et de l'intérêt de disposer d'une méthode de détection rapide, peu coûteuse et surtout très sensible.

INFECTIONS MASCULINES ET FERTILITE

Chez l'homme les agents infectieux susceptibles d'affecter la fertilité sont beaucoup plus variés avec CT, UU, N. Gonorrheae (NN) mais aussi de nombreux autres. En 1990, 2/3 des épididymites aiguës étaient dues soit à NG soit à CT [6].

Si, comme chez la femme, une infection peut entraîner une occlusion des voies excrétrices, l'infection du sperme, liée par exemple à une orchite chronique, est susceptible d'altérer sa valeur fonctionnelle ; les différents mécanismes théoriques potentiels en cause sont rappelés sur le tableau I. Certains mécanismes sont " subtils " et controversés.

Néanmoins de nombreuses controverses persistent en ce qui concerne, en particulier, le rôle des mycoplasmes et des leucocytes.

CT est capable non seulement d'adhérer au spermatozoïde, au niveau de la tête ou de la queue, mais est aussi capable de pénétrer et d'infecter la tête [7]. L'altération de la fécondité a souvent été attribuée à des dégradations tissulaires, fonctionnelles et même immunologiques du tractus génital et des spermatozoïdes [8].

Les patientes dont le mari est porteur de CT ont davantage d'infections génitales à tous les niveaux [9].

Les enquêtes démontrent, comme chez la femme, que la population à risques est représentée par les jeunes ayant une sexualité précoce et des partenaires multiples. De nombreuses atteintes sont silencieuses et un dépistage précoce est donc nécessaire chez ces adolescents afin de pouvoir les traiter pour réduire les conséquences de l'infection chez eux et éviter qu'ils contaminent leurs partenaires.

RAPPEL SUCCINCT DE LA MÉTHODOLOGIE EN BIOLOGIE MOLÉCULAIRE

La biologie moléculaire, depuis son apparition dans les années 60, a pu se développer quand on a mieux connu les structures et les fonctions des acides nucléiques et des protéines, mais surtout grâce à la mise au point des techniques d'amplification et des divers outils utilisés aujourd'hui permettant pour la microbiologie la détection et la quantification des acides nucléiques [10].

L'identification des séquences d'acides nucléiques spécifiques de l'agent recherché dans les prélèvements impose en effet d'abord une amplification puis l'utilisation d'une sonde qui fait appel à la propriété d'hybridation spécifique et signale la présence de la séquence homologue de l'ADN ou de l'ARN recherchée [10].

Dans un premier temps les acides nucléiques, contenus dans le prélèvement, sont purifiés soit par l'utilisation de résines échangeuses d'ions, soit, plus rapidement, par lyse des cellules sous l'action de la chaleur.

L'amplification génique consiste à copier de multiples fois les acides nucléiques caractéristiques à l'aide d'amorces spécifiques et d'une polymérase (PCR) ou ligase (LCR). La spécificité est en partie liée à la qualité de l'amorce.

Pour la révélation de la PCR des sondes spécifiques sont actuellement commercialisées pour CT et les mycoplasmes utilisant en général l'hybridation en milieu liquide [11]. Les amplifiats peuvent être analysés et identifiés par électrophorèse et hybridation après Southern blot avec cette sonde spécifique. Il existe d'autres variantes techniques de détection comme la fluorescence directe de l'ADN aux rayons ultraviolets en présence de bromure d'éthidium, en général après électrophorèse des produits amplifiés en gel d'agarose ou d'acrylamide [10].

Pour CT, la sensibilité est meilleure que la culture cellulaire, actuellement la méthode de référence, puisqu'elle dépasse 95 %, quant à la spécificité elle est proche de 100 %.

Selon les sondes utilisées la manipulation dure habituellement de 2 à 5 heures ; certains procédés peuvent cependant demander 24 à 48 heures. En comparaison la culture reste une technique lourde qui demande 48 à 72 heures. La détection antigénique, utilisée depuis près de 15 ans est soit subjective (immunofluorescence) soit peu sensible (certaines techniques Elisa). Quant à la sérologie elle est trop peu sensible [11].

Ces techniques moléculaires permettent surtout de rechercher CT sur de nouveaux sites chez la femme comme les urines, l'endomètre ou les trompes et aussi au niveau du cul-de-sac de Douglas, en raison de leur grande sensibilité. Chez l'homme la PCR permet de porter des diagnostics de chlamydiose soit dans le premier jet d'urines soit dans le sperme, ce qui permet d'éviter les prélèvements au niveau de l'urètre ([11].

Elles sont néanmoins encore coûteuses et non remboursées par la Sécurité Sociale.

L'avenir de ces techniques se situe dans l'automatisation et dans le développement de l'approche multiparamétrique qui contribuera à élaborer de véritables stratégies de dépistage systématique des agents pathogènes [10].

DONNEES ACTUELLES SUR L'UTILISATION DE LA PCR ET DE LA LCR

Chez la femme plusieurs évaluations des techniques de biologie moléculaire appliquées au diagnostic de CT ont été publiées.

Chez 945 femmes des prélèvements ont été effectués au niveau de l'endocol [12] ; la comparaison de la culture et de l'Amplicor CT (méthode d'amplification par PCR) montrent une supériorité statistiquement significative de l'Amplicor en ce qui concerne la sensibilité (96,5 % vs 86 %), alors que la spécificité atteint 100 % pour les deux techniques comparées ; pour la PCR l'efficience du test est de 99,7 % [12] ; la durée totale du test est de l'ordre de 4 à 5 heures.

Une étude semblable (utilisant même la méthode de PCR) réalisée chez 439 femmes consultant dans un centre de dépistage des MST, un centre de planification familiale et à la consultation d'un service de Gynécologie de Lisbonne, la sensibilité et la spécificité de la PCR pour les prélèvements endocervicaux sont respectivement de 92,9 et 100 % [13] ; dans les urines les pourcentages sont respectivement de 100 et 99,1 %.

Une autre étude a comparé la culture à la LCR au niveau de prélèvements endocervicaux sur le premier jet d'urine ; les résultats (tableau II) montrent une meilleure sensibilité de la LCR, alors que sa spécificité est proche de 100 % [14].

Chez l'homme une première étude a montré l'intérêt de la PCR pour rechercher la présence dans le sperme de donneurs pour lesquels la culture s'était avérée négative [15] ; en effet chez 3 donneurs CT a été retrouvé dans 2 éjaculats successifs, alors qu'il a été retrouvé dans un seul éjaculat chez 2 autres donneurs. La fréquence de la contamination des donneurs par CT dans la population des donneurs de ce centre souligne l'importance d'un dépistage rigoureux des donneurs.

Plusieurs méthodes diagnostiques de CT ont été utilisée chez 205 hommes infertiles, lors d'une consultation dans un centre d'andrologie, au niveau du sperme et au niveau de l'urètre [16]. Des anticorps (IgA) contre CT (ELISA) sont retrouvés 10 fois plus souvent que la bactérie elle-même dans le sperme. Dans le sperme CT a été retrouvé par PCR 1 fois pour 56 échantillons testés (1,8 %) et une fois seulement sur 139 (0,7 %) par EIA. 4 prélèvements urétraux sur 173 analysés se sont révélés positifs par la culture. Pour ces auteurs la recherche d'anticorps dans le plasma séminal a une valeur très limitée [16].

La recherche de CT a été effectuée dans le sperme de 402 hommes (64 dans le cadre d'une infertilité du couple, 174 ayant une altération du sperme, 32 dont l'épouse présentait une stérilité tubaire, 22 connus pour une chlamydiose chronique, 85 présentant une infection génitale symptomatique, 25 après échec de l'AMP, et 74 témoins dont 54 donneurs de sperme) soit par PCR (Amplicor), soit par culture cellulaire optimisée (CCO) soit enfin immunofluorescence directe (IFD) [16]. Aucune CCO n'a été positive dans le sperme alors que la PCR a été positive dans 6,5 % des cas ; l'IFD a été retrouvée positive dans 1,5 % des cas ; il existe bien sûr des variations importantes selon les groupes étudiés ; la PCR a été positive dans 2,7 % des cas du groupe témoin ; les plus forts pourcentages de positivité ont été obtenus dans les groupes des hommes présentant une infection génitale symptomatique (17,5 %) et ceux ayant une altération du sperme (10,6 %). En cas de chlamydiose chronique le pourcentage de positivité est de 8,4 % [16].

La LCR utilisée pour l'analyse de 542 prélèvements urétraux de 1 043 premiers jets d'urine a démontré une sensibilité et une spécificité respectivement de 98 et 100 % pour l'urètre et de 93,5 et 99,8 % pour les urines [14] ; la sensibilité de la LCR pour les urines est très supérieure à celle de la culture qui ne doit plus être considérée comme le standard de référence [2].

Une étude plus récente a recherché les bactéries présentes dans le sperme par PCR chez 30 hommes infertiles et 9 donneurs de sperme, aucun n'ayant le moindre symptôme évocateur d'une infection génito-urinaire [17] ; la PCR, avec une amorce eubactérienne universelle, a découvert la présence de bactéries chez 66 % des sujets des deux groupes, alors que les techniques habituelles de culture n'avaient été positives que chez 27 % des sujets, traduisant la sous-estimation fournie par les techniques habituelles.

COMMENTAIRES

Les infections génitales féminines et génito-urinaires masculines par chlamydia trachomatis sont responsables de stérilités ou associées à de nombreux cas d'infécondité. Les mécanismes en cause sont parfois évidents (obstructions) ; ils sont dans d'autres cas moins clairs.

Les nouvelles techniques de détection appliquant les techniques de biologie moléculaire s'avèrent plus sensibles et aussi spécifiques que la culture ; elles peuvent être utilisées dans les urines, facilitant l'acceptabilité des prélèvements pour les programmes de dépistage.

Les résultats sont souvent obtenus plus rapidement ; mais elles sont encore coûteuses et limitées à certains laboratoires. On peut espérer dans l'avenir des progrès qui permettront leur expansion et une plus grande accessibilité.

Compte tenu des conséquences néfastes de l'infection à CT et des difficultés à éradiquer l'infection ou les phénomènes immunologiques (tout aussi délétères) qui persistent, malgré l'absence de bactéries " actives ", le diagnostic précoce apparaît plus que jamais nécessaire dans les groupes à risque de MST et en particulier chez les adolescents. Les pays qui ont su développer des programmes de dépistages efficaces ont pu réduire de manière importante la fréquence de cette infection et l'épidémie.

Les techniques de biologie moléculaire représentent des outils performants non seulement pour le dépistage mais aussi pour une meilleure compréhension du rôle de l'infection dans l'infécondité en particulier chez l'homme.

BIBLIOGRAPHIE

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