CONGELATION DES OVOCYTES ET MATURATION IN VITRO : les nouveaux outils de l’AMP.

Michelle PLACHOT

C.H.I. Jean ROSTAND - Laboratoire FIV - 141 Grande Rue - 92310 SEVRES -

Parmi la panoplie des techniques utilisées actuellement dans les laboratoires d’AMP, deux sont en cours de mise au point et suscitent de grands espoirs : la congélation et la maturation in vitro des ovocytes.

Après un long silence d’une dizaine d’années, depuis les premières rares grossesses obtenues après congélation des ovocytes, l’année 1997 a été marquée par le renouveau de cette technique (pour revue Mandelbaum et coll., 1998). En effet, l’amélioration des conditions de congélation des ovocytes ainsi que l’ICSI, qui permet d’obtenir un taux de fécondation identique pour les ovocytes congelés ou non, ont permis à Porcu (1998) d’obtenir plusieurs grossesses et naissances. Cependant, l’efficacité reste faible et de nombreux aspects ne sont pas élucidés.

Indications

Actuellement, la congélation embryonnaire est le seul moyen de préserver les embryons dits "surnuméraires", conséquence de l’hyperstimulation ovarienne. Or, cette technique est source de problèmes à la fois légaux, moraux et religieux pour les praticiens, législateurs et les patients. La congélation des ovocytes est une alternative permettant de résoudre nombre de ces problèmes. Qui plus est, cette technique permet de préserver la fertilité des jeunes femmes ayant un traitement stérilisant par chimio ou radiothérapie. Enfin, elle serait l’équivalent de la banque de sperme pour prendre en charge les patientes dans le cadre du don d’ovocyte.

Théoriquement, les ovocytes peuvent être congelés à tous les stades de maturation, de la prophase I (stade de vésicule germinative, VG), à la métaphase II. Plusieurs études ont montré clairement que le stade de prophase I était le moins performant en terme de résultat global : survie, maturation in vitro, fécondation, développement embryonnaire et grossesses. C’est pourquoi la plupart des équipes congèlent actuellement les ovocytes au stade de métaphase II.

Nous avons initié un protocole expérimental de congélation ovocytaire, de manière à évaluer :

- la survie des ovocytes immatures après congélation-décongélation (C/D)

- leur capacité à réaliser leur maturation in vitro

- la survie des ovocytes mûrs après C/D

- l’intégrité chromosomique des ovocytes.

Ainsi parmi les 25 ovocytes immatures congelés seuls 5 ont survécu (20%). Quatre d’entre eux ont repris leur méïose et trois sont parvenus au stade de MII. Cette faible efficacité en terme de survie s’accompagne d’anomalies de la qualité ovocytaire : après fixation et coloration au Giemsa des ovocytes ayant survécu, cytoplasme et chromosomes apparaissent dégénératifs ce qui n’apparaissait pas à l’état frais.

Il n’en est pas de même pour les ovocytes congelés au stade de MII (ovocytes non fécondés d’ICSI). Ainsi 10/14 ont survécu (71%) et aucun ne présentait, après fixation, de dégénérescence cytoplasmique ou chromosomique. Aucune aneuploïdie n’a été notée dans cette série. De la même manière, le taux de cassures chromosomiques (1/14) est identique aux séries témoins de notre laboratoire (Plachot et coll., 1997).

Les ovocytes sont décoronisés par la hyaluronidase et dissection mécanique environ 1 heure après le recueil ovocytaire. Puis ils sont incubés au moins 6 heures avant la congélation (Tucker et coll., 1996). La technique de C/D est la même que celle utilisée pour les embryons et comprend l’incubation des ovocytes

- dans une solution de propanediol (PROH) 1.5M pendant 20 mn à température ambiante

- puis dans une solution de PROH 1.5M + 0.1M sucrose pendant 10 mn avant la mise en paillette

La descente en température est de :

- 2°C/mn de la température du laboratoire Þ - 6.5°C

- attendre 5mn l’équilibration de la température

- induction de la cristallisation

- 0.3°C/mn Þ - 38°C

- plonger les paillettes dans l’azote liquide.

Le réchauffement se fait rapidement en plongeant les paillettes dans un bain-marie à 31°C. Puis après dilution du cryoprotecteur, les ovocytes sont rincés 6 fois dans le milieu de culture contenant >= 15% de sérum ou >= 20% de HSA. Une heure plus tard, les ovocytes intacts sont microinjectés.

Plusieurs séries de résultats ont été présentées à l’ESHRE (Göteborg, Juin 1998) (tableau 1) et à l’IFFS (San Francisco, Octobre 1998) (tableau 2).

Ces résultats montrent tout d’abord le peu de tentatives réalisées ou présentées à ce jour puisque un peu plus de 150 patientes ont été inclues dans ce protocole. Le taux de survie des ovocytes est variable selon les équipes mais peut atteindre 56%. Le taux de fécondation après ICSI est globalement identique à celui obtenu avec des ovocytes frais. Enfin, une vingtaine de grossesses ont été initiées et moins de 10 enfants sont nés à ce jour. Le taux de grossesse reste donc faible et peut s’expliquer par d’éventuelles anomalies ovocytaires et/ ou embryonnaires induites par ce processus.

Plusieurs composants ovocytaires peuvent être endommagés par le processus de congélation-décongélation (pour revue Porcu et coll., 1998). Le fuseau méïotique est certainement de toutes les structures ovocytaires la plus fragile. En effet, il est formé de microtubules thermosensibles qui se dépolymérisent et repolymérisent en fonction de la température. Au stade de métaphase II, les chromosomes sont alignés sur le fuseau au niveau du centromère. Toute anomalie de repolymérisation au cours du réchauffement peut induire des aneuploïdies. Cependant, Gook et coll (1994) ont démontré que l’intégrité du fuseau des ovocytes humains était préservée au cours de la technique, et n’ont pas observé de chromosomes détachés du fuseau.

Le cytosquelette est une structure fibrillaire complexe, composée d’actine et ayant pour fonction de maintenir (ou modifier selon le cas) la forme de l’ovocyte de manière à favoriser, entre autre, le mouvement des organelles, des protéines membranaires et l’exocytose. Des altérations du cytosquelette ont été observées dans des ovocytes humains après C/D. Les granules corticaux peuvent subir une exocytose prématurée induisant une polyspermie par échec de la réaction corticale ainsi qu’une réduction du taux de fécondations normales.

Des lésions de la zone pellucide ont été observées après C/D.

Enfin, des activations parthénogénétiques ont également été rapportées, conséquence du choc thermique.

La maturation ovocytaire (MIV) a 3 composantes :

- la maturation nucléaire qui culmine par l’émission du 1er globule polaire

- la maturation membranaire, nécessaire pour la reconnaissance spécifique des spermatozoïdes

- la maturation cytoplasmique, complexe et plurielle, qui permet, entre autre, grâce à la réaction corticale d’éviter la polyspermie et qui assure les synthèses protéiques nécessaires au bon déroulement de la fécondation et du développement embryonnaire. Si les 2 premiers aspects sont facilement maîtrisés (observation du globule polaire, ICSI), il n’en est pas de même du troisième. En effet, les premières MIV des ovocytes humains ont été réalisées dès 1965, mais le faible taux de fécondation et de développement ultérieur fait que cette technique n’a eu quasiment aucune application clinique jusqu’en 1994 (pour revue Rutherford, 1998 ; Cha, 1998).

Aujourd’hui la MIV des ovocytes est réalisée essentiellement dans 4 cas :

- chez les patientes ayant une PCO (cycle naturel)

- chez les patientes normoovulantes (cycle naturel)

- lorsque la patiente n’a pas reçu d’hCG (cycle stimulé)

- lorsque des ovocytes immatures sont recueillis dans le cadre de l’ICSI (cycle stimulé).

Ces patientes ont des risques de développer une hyperstimulation ovarienne après stimulation classique dans le cadre de l’AMP. C’est pourquoi plusieurs auteurs ont tenté d’ obtenir des ovocytes immatures au cours de cycles spontanés : les ovocytes sont recueillis à partir de petits follicules (2 à 10 mm de diamètre) entre J5 et J12 du cycle. En moyenne, 15 ovocytes sont recueillis par patiente. Le milieu de culture est le plus souvent enrichi en E2 et gonadotrophines bien que les résultats aient démontré que ce n’était pas indispensable. Trounson et coll. (1994) ont montré que 60% des ovocytes pouvaient atteindre le stade de métaphase II, parmi lesquels 45% étaient fécondés normalement. Cependant, les auteurs ont noté un retard de développement embryonnaire probablement responsable du faible taux de grossesse (1grossesse/13 transferts). Un an plus tard, la même équipe rapporte la naissance d’une fille après l’application successive de plusieurs techniques biologiques : MIV, ICSI, co-culture des embryons sur cellules Vero jusqu’au stade blastocyste et éclosion assistée ! Cependant, le taux de grossesses reste désespérément bas : < 2% (Barnes et coll., 1995). C’est alors le groupe de Cha (1998) qui rapporte la plus grande série de grossesses en utilisant la même technique que celle de Barnes : 12 grossesses, représentant un taux de 25.5%.

Le recueil ovocytaire au cours d’un cycle naturel chez les femmes normoovulantes permet d’éviter les risques, effets secondaires et coût financier de la stimulation ovarienne. Russell et coll. (1997) ont obtenu des ovocytes à partir de follicules de 4 à 12 mm de diamètre, entre J7 et J12 du cycle. En moyenne 12 ovocytes étaient obtenus par patiente. Le milieu de maturation (TCM 199) comprenait 75mIU de FSH/ml + 500mIU/ml d’hCG + 1µg d’E2. Trois grossesses cliniques ont été obtenues après 54 transferts.

Mikkelsen et coll. (1998) ont étudié le rôle de la stimulation par FSH sur le développement ultérieur des ovocytes immatures. Ils ont donc prélevé des ovocytes immatures chez des femmes ayant une PCO et ayant soit, pas reçu de FSH, soit reçu de la FSH avec ponction 24 ou 72 heures après l’arrêt de la FSH. Deux grossesses ont été obtenues sur 10 cycles réalisés après FSH et prélèvement à 72 heures. La FSH semble donc favoriser le développement des ovocytes immatures chez ces patientes. En revanche, la même étude réalisée chez des femmes normoovulantes ne montre aucun effet bénéfique de la FSH. Ce qui est important c’est que 5 grossesses ont été obtenues au cours de 30 cycles, soit un taux de grossesse tout à fait acceptable de 17% par cycle et 19.2% par transfert.

Deux cas ont été rapportés dans la littérature de MIV chez des patientes n’ayant pas reçu, volontairement ou accidentellement, d’injection d’hCG. Liu et coll. (1997) rapportent le cas d’une patiente ayant oublié de faire l’injection : une grossesse a été obtenue après transfert d’un embryon congelé-décongelé provenant de la fécondation par ICSI d’un ovocyte ayant réalisé sa maturation in vitro en présence de FSH et d’hCG. Jaroudi et coll. (1997) réalisent la MIV des ovocytes d’une patiente ayant une hyperstimulation ovarienne : 40 follicules à l’échographie et un taux d’estradiol à 14 000 pmol/l. La MIV était une alternative à l’arrêt du cycle. Une grossesse a été obtenue qui s’est interrompue à 24 semaines après rupture prématurée des membranes.

Environ 15% des ovocytes recueillis après induction de l’ovulation dans le cadre de l’ICSI sont immatures, au stade de prophase ou métaphase I. Ainsi, en 1997, environ 22 000 ovocytes immatures ont été recueillis en France et la quasi totalité d’entre eux ont été éliminés. Il n’existe actuellement pas de grandes séries permettant de dire à quel taux ces ovocytes peuvent être "sauvés". Cependant quelques équipes rapportent la naissance d’un enfant après MIV (en l’absence de gonadotrophines) et fécondation par ICSI (Nagy et coll., 1996).

Pour essayer de comprendre les raisons de ces échecs, nous avons réalisé une étude cytogénétique des ovocytes provenant de maturation in vitro et avons comparé les résultats obtenus à ceux provenant de maturation in vivo (échec de fécondation après ICSI). Les ovocytes recueillis dans le cadre de l’ICSI sont décumulisés par la hyaluronidase puis incubés 24 à 44h dans 1 ml de milieu BM1 (Ellios Bio Media). Les ovocytes ayant atteint le stade de métaphase II sont alors placés dans une solution de citrate trisodique (0.8%) pendant 15mn à température ambiante. Ils sont ensuite déposés sur une lame dans une microgoutte de liquide et fixés par addition de 2 gouttes de fixateur (méthanol : acide acide acétique, 3:1). Les lames sont ensuite colorées au Giemsa (4%) pendant 6 mn et les ovocytes analysés selon les critères classiques de cytogénétique.

Les tableaux 3 et 4 montrent qu’il n’existe pas de différence dans le taux de diploïdie ou d’aneuploïdie des ovocytes provenant de maturation in vivo ou in vitro, qu’ils aient été recueillis au stade de prophase ou de métaphase I. En revanche, le taux de cassures chromosomiques est plus élevé après maturation in vivo (échecs d’ICSI). On note également un taux plus élevé de séparation des chromatides après maturation in vitro principalement observée pour les ovocytes recueillis au stade de métaphase I (tableau 4). Nous n’avons observé aucun effet de l’origine des ovocytes (indication masculine pure ou non), de l’âge maternel (< ou > à 35 ans) et du type de stimulation ovarienne (FSH rec ou HMG ou FSH) sur le taux d’anomalies chromosomiques. En revanche, la séparation prématurée des chromatides était préférentiellement observée chez les femmes âgées et après utilisation de FSH rec. Cette anomalie pourrait induire des malségrégations chromosomiques lors de l’achèvement de la méïose, augmentant ainsi le risque d’aneuploïdie embryonnaire. Ces observations, rassurantes sur le plan de l’utilisation d’ovocytes maturés in vitro à des fins cliniques, ne permettent pas d’expliquer les échecs de développement des embryons qui en résultent.

Pour évaluer la qualité des ovocytes humains obtenus après maturation in vitro (MIV), certains auteurs ont étudié leur profil protéïque et l’on comparé à celui des ovocytes obtenus par maturation in vivo. Par électrophorèse bidimensionnelle, ils ont observé une réduction importante, voire l’absence de plusieurs protéines de 10 000 à 120 000 kDa dans les ovocytes prélevés au cours de cycles spontanés et maturés in vitro, en présence de FSH et LH rec., comparés aux témoins. En revanche, les ovocytes immatures recueillis après stimulation de l’ovulation et maturés in vitro dans les mêmes conditions présentent un profil protéïque proche de celui des témoins. Ces résultats expliquent sans doute les mauvais résultats, en terme de grossesse, observés après MIV d’ovocytes recueillis au cours de cycles spontanés, mais n’expliquent pas les résultats médiocres également observés après MIV des ovocytes recueillis immatures au cours d’un cycle de FIV, et donc ayant reçu FSH et hCG.

Lors de la fécondation, la pénétration du spermatozoïde induit un pic de calcium intracellulaire suivi d’oscillations soutenues. Ceci est essentiel pour la réalisation normale de l’exocytose des granules corticaux, l’achèvement de la méïose, la formation des pronuclei et le développement embryonnaire. Après maturation in vitro, la pénétration du spermatozoïde déclenche effectivement un pic de calcium intracellulaire qui n’est pas suivi d’oscillations. Ceci pourrait expliquer les anomalies observées après MIV.

Des anomalies du développement embryonnaire ont été rapportées avec un ralentissement des divisions mitotiques allant jusqu'à un arrêt complet avant le stade blastocyste. Selon les études, le taux de blastocystes varie de 0 à 13%.

Nous avons, à l’Hôpital de Sèvres, initié un protocole de MIV. Les résultats préliminaires sur 15 patientes et 24 ovocytes montrent un taux de fécondation par ICSI de 33% pour les ovocytes recueillis au stade de VG et 58% pour ceux recueillis au stade de MI. Onze zygotes ont été cultivés en milieu M3 (jusqu'à J2) puis S2 (jusqu'à J5). Aucun n’a atteint le stade de blastocyste, tous se sont bloqués entre les stades stade 2 et 10 cellules. Les zygotes témoins (fécondations normales, FIV) cultivés dans ces conditions montrent un taux de blastocystes de 38% et 7 grossesses ont été obtenues après 12 transferts de blastocystes.

· Barnes F.L., Crombie A., Gardner D.K., Kausche A., Lacham-Kaplan O., Suikkari A.M.,Tiglias J., Wood C., Trounson A. O., Blastocyst development and birth after in-vitro maturation of human primary oocytes, intracytoplasmic sperm injection and assisted hatching, Hum. Reprod., 1995, 10, 3243-3247.

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