La maturation in vitro
M. PLACHOT
La maturation ovocytaire (MIV) a 2 composantes
essentielles :
- la maturation nucléaire
qui culmine par l'émission du 1er globule polaire
- la maturation cytoplasmique,
complexe et plurielle, qui permet, entre autre, grâce à la réaction
corticale d'éviter la polyspermie et qui assure les synthèses protéiques
nécessaires au bon déroulement de la fécondation et du développement
embryonnaire. De leur synchronie dépend le bon déroulement des événements
ultérieurs. Si la maturation nucléaire est assez bien maîtrisée
in vitro, il n'en est pas de même de la maturation cytoplasmique. En effet,
les premières tentatives de MIV des ovocytes humains ont été réalisées
dès 1965, mais le faible taux de fécondation et de développement
embryonnaire ultérieur fait que cette technique n'a eu quasiment aucune application
clinique jusqu'en 1994 (pour revue Rutherford, 1998 ; Cha, 1998).
Aujourd'hui la MIV des ovocytes est
réalisée essentiellement dans 2 cas :
- chez les patientes atteintes
d'un syndrome des ovaires polykystiques (SOPK),
- chez les patientes normoovulantes
ayant une FIV au cours d'un cycle spontané.
Le syndrome des ovaires polykystiques
Les patientes ayant un syndrome des ovaires polykystiques
ont des risques de développer une hyperstimulation ovarienne après stimulation
classique dans le cadre de l'AMP. C'est pourquoi plusieurs auteurs ont prélevé
des ovocytes immatures au cours de cycles spontanés : les ovocytes sont recueillis
à partir de petits follicules (2 à 10 mm de diamètre) entre J5 et
J12 du cycle. En moyenne, 15 ovocytes sont recueillis par patiente. Le milieu de
culture est le plus souvent enrichi en E2 et gonadotrophines bien que les résultats
aient démontré que ce n'était pas indispensable. Trounson et coll.
(1994) ont montré que 60 % des ovocytes pouvaient atteindre le stade de métaphase
II, parmi lesquels 45 % étaient fécondés. Cependant, les auteurs
ont noté un retard de développement embryonnaire probablement responsable
du faible taux de grossesse (1grossesse/13 transferts). Un an plus tard, la même
équipe a rapporté une naissance après l'application successive de
plusieurs techniques biologiques : MIV, ICSI, co-culture des embryons sur cellules
Vero jusqu'au stade blastocyste et éclosion assistée ! Cependant, le taux
de grossesses restait désespérément bas : < 2 % (Barnes et coll,
1995). C'est alors Cha (1998) qui rapporte la plus grande série de grossesses
en utilisant la même technique que celle de Barnes : 10 grossesses, soit un
taux de 26.8 %.
Plus récemment, dans une étude
cas-témoin, Child et coll (2002) ont comparé FIV et MIV+FIV chez des patientes
ayant un SOPK. Ils n'ont observé aucune différence significative dans
le taux de grossesse et le taux de naissances entre le groupe FIV (38.3 % et 26.2
%) et le groupe MIV+FIV (26.2 % et 15.9 %). Le taux d'implantation était toutefois
supérieur dans le premier groupe (17.1 % vs 9.5 %) ainsi que le taux d'hyperstimulation
modérée ou sévère (11.2 % vs 0).
La MIV pourrait donc être un moyen
d'éviter les hyperstimulations sévère chez ces patientes à condition
que les chances de grossesse ne soient pas trop diminuées, ce qui est le cas,
sauf dans de rares publications.
La FIV au cours d'un cycle spontané
Le recueil ovocytaire au cours d'un cycle naturel
chez les femmes normoovulantes permet d'éviter les risques (hyperstimulation...),
contraintes (prises de sang répétées, échographies), effets
secondaires et coût financier de la stimulation ovarienne. Russell et coll.
(1997) ont obtenu des ovocytes à partir de follicules de 4 à 12 mm de
diamètre, entre J7 et J12 du cycle. En moyenne 12 ovocytes ont été
obtenus par patiente. Le milieu de maturation (TCM 199) comprenait 75mIU de FSH/ml,
500mIU/ml d'hCG et 1μg d'E2. Trois grossesses cliniques ont été obtenues
après 54 transferts.
Le taux de maturation varie d'une femme
à l'autre et semble être un bon critère prédictif de la qualité
ovocytaire. Ainsi, le taux de MIV des ovocytes de femmes ayant déjà obtenu
une grossesse (69.8 %) est supérieur à celui des femmes n'ayant jamais
conçu (36.7 %, p<0.001). En conséquence, un taux de MIV bas est de
mauvais pronostic même lorsque les taux de FSH et d'E2 sont normaux à
J3 (Russell et coll,1998).
Là encore, le « coût-bénéfice»
de la MIV doit être évalué : un faible coût, pour de faibles
chances de grossesse.
Les mauvaises répondeuses
Selon Liu et al (2003), une mauvaise réponse
à la stimulation est définie par un taux d'estradiol < 1000 pg/ml le
jour du déclenchement de l'ovulation par l'hCG, et un maximum de 4 ovocytes
recueillis. Elle n'est pas rare chez les femmes de plus de 38 ans, mais elle peut
également survenir chez des femmes jeunes au profil endocrinien normal. Souvent
le cycle de FIV est annulé et le taux de grossesse est bas. Les auteurs ont
proposé - au lieu d'annuler le cycle - de recueillir des ovocytes
immatures chez ces femmes ayant une mauvaise réponse à la stimulation
par le GnRHa et la Metrodine HP. En moyenne, 5.1 ovocytes ont été recueillis
chez des femmes d'âge moyen 30.5 ans. Ils ont été cultivés en
présence de FSH (0.075 IU/ml), hCG (0.075 IU/ml), 17 b estradiol (0.5mg/ml)
et 10 % de liquide folliculaire humain (provenant de femmes ayant un cycle de FIV
après stimulation de l'ovulation). Au total 80.5 % des ovocytes ont atteint
le stade de métaphase II et 78.5 % de ceux-ci ont été fécondés
par ICSI. Les auteurs rapportent 3 grossesses sur une petite série de 8 cycles
; le taux d'implantation est de 20 %. Le bénéfice de la MIV doit bien
sûr être évalué sur une plus grande série.
Rôle d'un priming par la FSH ou l'hCG
Mikkelsen et coll. (1998) ont étudié
le rôle d'une stimulation par la FSH sur le développement ultérieur
des ovocytes immatures chez des femmes atteintes d'un syndrome des ovaires polykystiques.
Ils ont donc prélevé des ovocytes immatures, soit chez des femmes n'ayant
pas reçu de FSH, soit chez des femmes ayant reçu de la FSH avec ponction
24 ou 72 heures après l'arrêt de la FSH. Deux grossesses ont été
obtenues sur 10 cycles réalisés après FSH et prélèvement
72 heures plus tard. La FSH semble donc favoriser le développement des ovocytes
immatures chez ces patientes. En revanche, la même étude réalisée
chez des femmes normoovulantes ne montre aucun effet bénéfique de la FSH.
Cinq grossesses ont été obtenues au cours de 30 cycles, soit un taux de
grossesse de 17 % par cycle et 19.2 % par transfert.
Un priming par hCG (36 heures avant
le recueil ovocytaire) a également été proposé par Chian et
coll (1999, 2000) et s'est révélé pour ces auteurs supérieur
au priming par FSH.
Les résultats de la littérature
Selon Poirot et coll (2003) l'analyse de la littérature
(jusqu'en avril 2003) montre que 224 grossesses ont été obtenues par MIV,
toutes indications confondues. Le taux d'implantation est de 9.5 %, plus faible
que celui obtenu en FIV. Le taux de FCS est de 12.7 %, et 19.9 % des grossesses
sont multiples. Au moins 91 enfants sont nés en bonne santé. Un enfant
né à 24 semaines d'aménorrhée après rupture des membranes
est mort à 18 jours.
Mikkelsen et coll (2003) ont évalué
l'état de santé à 18 mois de 32 enfants nés après MIV et
ICSI. Ils n'ont observé aucune différence par rapport au registre national.
Seul point notable, les enfants sont gros à la naissance, 3700 g en moyenne.
S'agit-il du syndrome du gros veau (lié aux conditions de culture) ? Non, disent
les auteurs, les enfants danois sont grands et ceci explique cela. Au total ils
ont observé un mort-né, une fente palatine, et à 18 mois, 2 enfants
avaient un léger retard de langage qui ne semblait pas préoccupant. Vingt
trois enfants ont eu un caryotype qui s'est révélé normal.
Etude pilote Pitié/Jean Verdier
La maturation in vitro a été proposée
à 10 femmes (d'âge moyen 31,75 ans) ayant, soit un syndrome des ovaires
polykystiques, soit une ovulation normale mais des risques de faire une hyperstimulation
en raison d'antécédents d'hyperstimulation ou de réponse multifolliculaire
lors d'un cycle antérieur (Poirot et al, 2003). Un accord a été obtenu
du CCPPRB de l'hôpital Pitié-Salpétière. Un prétraitement
par de faibles doses de FSH a été réalisé et 10 000 UI d'hCG
ont été administrées 36h avant la ponction. Les ovocytes immatures
ont été incubés dans le milieu de maturation préparé par
Cryobiosystème dans le cadre de l'étude. Ce milieu (TC 199) était
supplémenté avec 20 % de sérum des patientes, de la FSH et de la
LH. La culture s'est déroulée en microgouttes sous huile en présence
des cellules du cumulus pendant 24 à 48 heures. La fécondation a été
réalisée par ICSI.
Comment expliquer l'efficacité modeste de la maturation
in vitro des ovocytes ?
Les anomalies chromosomiques
Nous avons réalisé une étude cytogénétique
des ovocytes provenant de maturation in vitro et avons comparé les résultats
à ceux provenant de maturation in vivo (échec de fécondation après
ICSI) (Plachot, 1999). Les résultats montrent qu'il n'existe pas de différence
dans le taux de diploïdie ou d'aneuploïdie des ovocytes provenant de maturation
in vivo ou in vitro, qu'ils aient été recueillis au stade de prophase
ou de métaphase I. En revanche, le taux de cassures chromosomiques est plus
élevé après maturation in vivo. On note également un taux plus
élevé de séparation des chromatides après maturation in vitro
principalement observée pour les ovocytes recueillis au stade de métaphase
I. Nous n'avons observé aucun effet de l'origine des ovocytes (indication masculine
pure ou non), de l'âge maternel (< ou > à 35 ans) et du type de
stimulation ovarienne (FSH rec ou HMG ou FSH) sur le taux d'anomalies chromosomiques.
En revanche, la séparation prématurée des chromatides était
préférentiellement observée chez les femmes âgées et après
utilisation de FSH rec. Cette anomalie pourrait induire des malségrégations
chromosomiques lors de l'achèvement de la méïose, augmentant ainsi
le risque d'aneuploïdie embryonnaire.
Wang et Keefe (2002) ont évalué
l'état du fuseau et l'alignement des chromosomes des ovocytes ayant réalisé
leur maturation in vitro grâce au Polscope. Ils ont observé que 29 % des
ovocytes ayant un fuseau biréfringent, et tous les ovocytes n'ayant pas de
fuseau biréfringent ont des anomalies dans l'organisation des microtubules
et l'alignement des chromosomes. De la même manière, l'analyse par FISH
(avec des sondes spécifiques pour les chromosomes X, Y, 13, 16, 18, 21 et 22)
de 41 embryons humains obtenus par MIV et FIV a montré que 45 % des blastomères
étaient multinuclées et que seuls 9.8 % des embryons étaient normaux.
Bien que la littérature mériterait d'être complétée sur
ce point, les anomalies chromosomiques semblent être impliquées dans la
diminution de la viabilité des embryons issus de MIV.
Les anomalies protéïques
Pour évaluer la qualité des ovocytes
humains obtenus après maturation in vitro (MIV), certains auteurs ont étudié
leur profil protéïque et l'on comparé à celui des ovocytes obtenus
par maturation in vivo. Par électrophorèse bidimensionnelle, ils ont observé
une réduction importante, voire l'absence de plusieurs protéines de 10
000 à 120 000 kDa dans les ovocytes prélevés au cours de cycles spontanés
et maturés in vitro, en présence de FSH et LH rec., comparés aux
témoins. En revanche, les ovocytes immatures recueillis après stimulation
de l'ovulation et maturés in vitro dans les mêmes conditions présentent
un profil protéïque proche de celui des témoins (Anderiesz et coll,
1998).
Développement anormal des signaux calciques
Lors de la fécondation, la pénétration
du spermatozoïde induit un pic de calcium intracellulaire suivi d'oscillations
soutenues. Après maturation in vitro, la pénétration du spermatozoïde
déclenche effectivement un pic de calcium intracellulaire qui n'est pas suivi
d'oscillations (Herbert et coll, 1997). Or, ceci est essentiel pour la réalisation
normale de l'exocytose des granules corticaux, l'achèvement de la méïose,
la formation des pronuclei et le développement embryonnaire.
Anomalies du développement embryonnaire
Des anomalies du développement embryonnaire
ont été rapportées avec un ralentissement des divisions mitotiques
allant jusqu'à un arrêt complet avant le stade blastocyste. Selon les
études, le taux de blastocystes varie de 0 à 13 %. Ainsi, chez le singe
rhésus, après MIV, le développement embryonnaire est identique au
témoin jusqu'au stade 8 cellules, stade de l'activation du génome embryonnaire.
Puis, la transcription nucléaire (attestée par l'expression de la fibrillarine)
diminue par rapport au témoin (Schramm et coll, 2003). Selon les auteurs, cela
serait du à une maturation cytoplasmique incomplète.
La co-culture d'embryons provenant
d'ovocytes ayant réalisé leur maturation in vitro sur des cellules d'ampoule
tubaire humaine améliore le développement in vitro comparé aux techniques
de culture standard. Ainsi, 48 embryons provenant de MIV et cultivés en milieu
HTF en présence de 150mUI/ml d'hMG, de 10 % de serum de veau fœtal et de 1
μg/ml d'estradiol se sont bloqués entre les stades 2 et 16 cellules. A
l'inverse, 46 embryons mis en co-culture ont conduit à la formation de 14 blastocystes
dont 2 ont éclos à J7.
Comment définir un bon protocole de maturation in
vitro ?
Il est maintenant bien établi que les conditions
de culture affectent l'expression génique et le métabolisme cellulaire.
Il est donc essentiel de définir les conditions de culture optimales pour la
maturation in vitro. Or, les données sont confuses et les choix empiriques.
Un des rôles majeurs des cellules
du cumulus est le transport de petites molécules vers l'ovocyte via les jonctions
perméables. Or, si la capacité des ovocytes à reprendre et achever
leur maturation in vitro est indépendante de la présence ou non des cellules
du cumulus, il n'en est pas de même pour ce qui concerne la fécondation
et le développement embryonnaire. Il est donc recommandé de ne pas décumuliser
les ovocytes avant MIV. La définition de conditions de culture permettant une
survie optimale des cellules du cumulus et de l'ovocyte est donc essentielle.
Plusieurs milieux de culture ont été
testés : IVF 20, G1, CCM (Vitrolife) et IVF (Médicult). Les 2 meilleurs
milieux en terme de taux de maturation sont CCM et IVF 20. La différence essentielle
avec les autres milieux est qu'ils contiennent de la FSH, de l'hCG, de l'estradiol
et de la progestérone alors que les autres n'en contiennent pas (Gadea et coll,
2003). Le pyruvate est la source d'energie privilégiée pour la MIV. Le
type de milieu de culture et le stade de maturation nucléaire (PI ou MI) modulent
la consommation de pyruvate et la production de lactate (Roberts et coll, 2002).
Le MAS (meiosis activating sterol) à la concentration de 10 ou 30μg/ml
augmente le taux de maturation des ovocytes immatures recueillis (après stimulation)
dans le cadre de l'ICSI. En revanche, aucun effet n'a été observé
sur les ovocytes immatures (recueillis au cours de cycles spontanés) des patientes
ayant un SOPK (Cavilla et coll, 2001). L'IVM qui contient de l'EGF (epidermal growth
factor) et du FGF (fibroblast growth factor) a été utilisé avec succès
par Chian et Tan (2002). Ils ont observé un taux identique de maturation que
les ovocytes aient été recueillis en métaphase I (78.6 %) ou en prophase
I (75.7 %). En revanche, bien que faible, le taux d'embryons atteignant le stade
blastocyste est moins bon dans ce dernier cas (12.9 % vs 19.6 %).
Selon Smith et coll (2000), la durée
de la maturation in vitro (28h ou 36h) témoin du stade initial de maturation
des ovocytes n'influe pas sur le taux de grossesse, 14 % et 15 %, respectivement.
Une des raisons des échecs d'implantation
après MIV pourrait être l'échec d'éclosion des blastocystes.
En effet, alors que 73.2 % des blastocystes de souris obtenus in vivo peuvent éclore
in vitro, seuls 6.3 % de ceux obtenus après MIV arrivent à éclosion.
L'éclosion assistée réalisée à J3 augmente significativement
le taux de blastocystes capables d'éclore à J5. Les auteurs concluent
que l'éclosion assistée pourrait améliorer les chances d'implantation
après MIV (Junk et coll, 2003).
Les gonadotrophines jouent un rôle
dans le développement folliculaire, l'expansion du cumulus et la maturation
ovocytaire. En effet, bien qu'aucune étude n'ait montré la présence
de récepteurs à la LH dans les ovocytes, des mRNA des récepteurs
à la FSH et la LH ont été observés dans les ovocytes, les zygotes
et les embryons préimplantatoires de souris (Patsoula et coll, 2001). Les effets
de la FSH et de la LH peuvent également passer via des médiateurs paracrines
provenant entre autre des cellules de la granulosa. Ces médiateurs sont les
facteurs de croissance, les cytokines, etc. Ainsi, la FSH permet chez la souris
d'obtenir après MIV des fœtus à un taux identique à celui obtenu
après maturation in vivo. Si l'addition de FSH, LH (ou hCG) et E2 au milieu
de culture des ovocytes recueillis au cours de cycles spontanés semble logique,
la supplémentation hormonale in vitro des ovocytes recueillis au cours d'un
cycle stimulé est discutable et les opinions des auteurs divergent sur ce point.
L'epidermal growth factor (EGF) joue
un rôle sur l'expansion du cumulus et la maturation ovocytaire, et de plus
en plus d'équipes l'ajoutent au milieu de culture des ovocytes. Chez les bovins,
la bGH (hormone de croissance bovine) augmente le taux d'ovocytes atteignant le
stade de métaphase II à 16h (mais pas à 24h) et donc accélère
la maturation ovocytaire. Elle augmente également l'expansion du cumulus (moins
que les gonadotrophines), ainsi que le taux de blastocystes. Cette action passe
par les cellules du cumulus (aucun effet sur les ovocytes dénudés), et
n'est pas médiée par l'IGF 1. En effet, des récepteurs à la
GH sont présents sur le cumulus, la granulosa et les ovocytes (Bevers et Izadyar,
2002).
Pour conclure, les résultats cliniques
de la MIV de l'ovocyte humain se rapprochent doucement de ceux de la FIV après
stimulation ovarienne, sans toutefois les égaler sauf dans de très rares
équipes. Si la maturation nucléaire ne pose aucun problème, il est
clair que le facteur clé est la maturation cytoplasmique encore mal maîtrisée
dans l'espèce humaine.Bibliographie
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280 M.
PLACHOT LA
MATURATION IN VITRO 281
282 M.
PLACHOT Résultats
Nombre moyen d'ovocytes recueillis 16.2
Taux de maturation 65.2 %
Taux de fécondation 48 %
Taux de zygotes à 3 PN 18.9 %
Nombre moyen d'embryons / patiente 4.6
Nombre de transferts 13
Nombre moyen d'embryons / transfert 2.8
Nombre de grossesses 1 gémellaire
Taux de grossesse par transfert 1/13
Nombre d'hyperstimulations 0
Ces résultats montrent que la maturation
in vitro des ovocytes humains est possible, avec fécondation, développement
embryonnaire et naissance de quelques enfants. Cependant le taux de grossesse est
moins bon que celui de la fécondation in vitro assistée ou non et indique
que la viabilité embryonnaire est compromise.
LA
MATURATION IN VITRO 283
284 M.
PLACHOT LA
MATURATION IN VITRO 285
286 M.
PLACHOT LA
MATURATION IN VITRO 287
288 M.
PLACHOT LA
MATURATION IN VITRO 289 |