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Prise
en charge des patientes virémiques au laboratoire
Michelle
Plachot
CHI Jean Rostand
141 Gde rue , 92311 Sèvres
Le problème
des couples sérodifférents pour le VHC ou le VIH et demandant l’aide de la médecine
pour procréer est au cœur du débat éthique (voir débat Auroux, Plachot). Cependant,
il existe des différences fondamentales entre ces 2 maladies virales, différences
liées à la gravité de la maladie ainsi qu’au risque de transmission intraconjugale
et à l’enfant à naître. On considère aujourd’hui que l’on peut accepter en AMP
les couples chez lesquels l’un des 2 membres est virémique pour le VHC mais
qu’en ce qui concerne le VIH, seuls les hommes virémiques peuvent être acceptés,
les risques pour l’enfant à naître étant pour l’instant trop élevé lorsque la
femme est infectée.
Trois techniques permettent de prendre ces couples en charge en AMP, soit pour
remédier à leur infertilité, soit pour diminuer les risques de contamination
intraconjugale :
- l’insémination
intra-utérine (IIU)
- la fécondation
in vitro (FIV)
- la microinjection
d’un spermatozoïde dans l’ovocyte (ICSI)
La
problématique de la prise en charge de ces couples au laboratoire d’AMP comprend
le risque de manipulation de produits biologiques infectés (risques pour le
personnel et les autres patientes) et la nécessité de diminuer (si possible
annuler) la charge virale de ces produits biologiques avant leur utilisation.
Pour ce qui concerne le premier point , la rédaction d’un protocole extrêmement
précis pour la manipulation de ces fluides contaminés au laboratoire est indispensable.
La fédération des BLEFCO a rédigé ce protocole (voir annexe). En bref, les mesures
générales comprennent la protection du personnel (port de gants, lunettes et
masque, éviter l’utilisation d’objets piquants ou tranchants, travailler sous
hotte à flux laminaire horizontal…) ainsi que la protection des gamètes et embryons
de couples indemnes en cours de traitement au laboratoire pendant la même période
(dissociation des prélèvements dans le temps, ne traiter qu’un patient à la
fois, utiliser si possible une étuve indépendante…). Pour ce qui concerne la
manipulation des liquides biologiques, gamètes ou embryons potentiellement infectés :
traiter les prélèvements un par un, désinfecter les surfaces et appareils selon
des protocoles spécifiques appropriés, éviter les liquides folliculaires sanglants,
effectuer des rinçages multiples, travailler si possible sous huile, congeler
en paillettes haute sécurité, etc. Ces précautions spécifiques s’ajoutent aux
précautions universelles de sécurité (circulaire DGS/DH du 20/4/98) devant être
respectées dans tout laboratoire d’AMP, car tout patient doit être considéré
comme porteur potentiel d’une affection virale asymptomatique.
Récemment , 2 cas de transmission nosocomiale du virus de l’hépatite C
ont été rapportés au cours d’une AMP alors que les couples séronégatifs étaient
traités le même jour qu’un patient connu pour être infecté (Lesourd et coll,
2000). Cela met en évidence le rôle essentiel du respect des précautions de
sécurité lors de la prise en charge de ces couples. Cependant, ces précautions
ne sont pas toujours mentionnées dans les articles (Marina et coll, 1998).
Dans
le cas de l’insémination intra-utérine, seul le sperme est préparé au
laboratoire. Ainsi, dans le cas du VHC, lorsque la femme est virémique le sperme
est normal et la réalisation de l’insémination ne pose aucun problème technique.
Lorsque l’homme est virémique, le sperme peut être infecté et doit donc être
préparé avant l’AMP. La préparation du sperme en vue de diminuer la charge virale
comprend une centrifugation sur gradient de densité suivie d’une migration ascendante
(Semprini et coll, 1992). Habituellement, l’une ou l’autre de ces techniques
est utilisée pour la préparation du sperme en vue de sélectionner les spermatozoïdes
les plus mobiles, éliminant ainsi les spermatozoïdes morts, les cellules rondes,
les débris, les bactéries, etc…
Dans la centrifugation sur gradient de densité, les spermatozoïdes sont centrifugés
dans une solution comprenant plusieurs concentrations de silice colloïdale (Puresperm
de chez Nidacon par exemple) ; les spermatozoïdes lavés sont recueillis
au fond du tube. Puis cette suspension de spermatozoïdes est déposée au fond
d’un tube dans lequel est ajouté du milieu de culture. Les spermatozoïdes mobiles
colonisent alors le milieu de culture par migration ascendante et ceux parvenus
dans la couche supérieure seront utilisés pour l’AMP. Ces 2 techniques , appliquées
dans cet ordre conduisent à une diminution de la charge virale du sperme qui
devient inférieure à 200 copies (seuil de détection) dans plus de 90% des échantillons
testés.
Dans le cadre de l’IIU, l’insémination est réalisée avec 1 à 10 millions de
spermatozoïdes lavés.
Dans
le cas de la FIV, liquide folliculaire et sperme sont traités au laboratoire.
Si la femme est virémique pour le VHC, le liquide folliculaire (le plus souvent
sanglant) est infecté. Aujourd’hui, aucune étude ne permet de montrer que les
ovocytes et les cellules folliculaires qui les entourent peuvent être débarrassés
du virus. Il est vraisemblable cependant que la décoronisation (retrait enzymatique
des cellules péri-ovocytaires) et des lavages successifs dans du milieu de culture
pourraient diminuer considérablement le risque viral. Par ailleurs, le sérum
de la patiente ne doit pas être utilisé comme additif au milieu de culture ou
de congélation embryonnaire ; il est recommandé d’utiliser dans ce cas
des substituts de sérum commercialisés.
Si l’homme est virémique, le sperme est préparé comme précédemment.
L’insémination est réalisée in vitro avec environ 60 000 spermatozoïdes / ml.
L’insémination en microgouttes (50µl) permet de réduire à environ 5000 le nombre
de spermatozoïdes en contact avec l’ovocyte.
Dans
le cas de l’ICSI, 1 seul spermatozoïde est injecté dans l’ovocyte et
il n’y a aucun contact entre les spermatozoïdes potentiellement infectés et
le tractus génital féminin. C’est donc à priori la technique de choix. Cependant,
si la présence de virus dans le spermatozoïde est conflictuelle, les risques
liés au fait que des virus peuvent être collés sur le spermatozoïde et pénétrer
dans l’ovocyte au moment de l’injection n’a pas encore été évalué. D’après P.
Jouannet, le risque d’infection des embryons n’est que de 1/200 000 après préparation
des spermatozoïdes et contrôle viral.
Dans
tous les cas, l’AMP n’est réalisée que lorsque la charge virale est inférieure
à un seuil variable selon les équipes : 800 copies pour l’équipe italienne
( Semprini et coll, 1992) ou 200 copies pour les équipes espagnoles (Marina
et coll, 1998 ; Coll et coll, 1999). L’absence de contamination des conjointes
sur plus de 2000 cycles d’IIU, de FIV ou d’ICSI montre, soit que le sperme est
complètement débarrassé du virus, soit que l’inoculum est trop faible pour être
infectant.
Le
cas du VHC
On
estime que 600 000 personnes sont porteuses du virus en France, avec une prévalence
de 1% dans la population générale, soit 2% parmi les couples. Trois grands modes
de contamination sont connus : la transmission sanguine (aujourd’hui interrompue),
la toxicomanie et la transmission nosocomiale. La transmission sexuelle semble
extrêmement faible, inférieure à 3%. Comme pour le reste de la population, 15%
de ces couples sont stériles, et ont besoin de l’AMP pour procréer.
Deux études françaises récentes montrent la présence de virus dans le sperme.
Selon Lévy et coll (2000), 2 patients sur 39 présentant une hépatite C active
avaient de l’ARN viral dans le sperme ; après sélection des spermatozoïdes
mobiles sur gradient de densité, tous les prélèvements étaient négatifs (seuil
de détection 200 copies du génome VHC/ml). Leruez-Ville et coll (2000) avec
un seuil de détection à 100 copies, ont retrouvé de l’ARN du VHC dans le sperme
de 2 patients HIV négatifs / 6 (33%) et de 6 patients HIV positifs / 15 (40%)
.
Il y a donc du virus dans le sperme et celui-ci doit être manipulé au laboratoire
de FIV avec les plus grandes précautions. Après préparation, l’AMP peut être
réalisée avec un risque minimal , voire nul d’infection.
La prise en charge de ces couples en AMP en France est aujourd’hui effective
dans le cadre d’un protocole clinique national multicentrique dont le promoteur
est l’Agence Nationale de Recherches sur le Sida (ANRS) et qui a reçu l’agrément
du CCPPRB de Créteil et l’aval de la DGS.
Le
cas du VIH
Dès
1989, Semprini proposait de réaliser des inséminations intraconjugales avec
le sperme préparé par lavage, centrifugations successives et migration ascendante
afin de diminuer la charge virale spermatique et par voie de conséquence, les
risques d’infection. La suspension de spermatozoïdes était testée par PCR à
la recherche d’ ARN viral avec une sensibilité de 800 copies / ml. Seuls les
spermes préparés négatifs en PCR étaient utilisés pour l’insémination. Les couples
étaient informés du risque résiduel lié à la sensibilité de la technique.
Il est important de signaler que les seules alternatives à l’AMP pour ces couples
sont le don de sperme et les rapports programmés. Sur les 103 grossesses rapportées
après rapports programmés, 17 sont survenues après un seul rapport sexuel, aucune
contamination n’est survenue au décours du rapport fécondant, mais 2 contaminations
ont eu lieu en fin de grossesse et 2 autres après l’accouchement chez des couples
qui n’utilisaient pas régulièrement le préservatif.
Dans l’ensemble, très peu de centres prennent en charge l’AMP pour les couples
sérodifférents pour le VIH : 1 en Italie (Semprini et coll, 1992), 3 en
Espagne (Marina et coll, 1998 ; Coll et coll, 1999), et une faible activité
débutante en Allemagne, Autriche, Suisse et Grande Bretagne. Les laboratoires
devraient répondre à des normes de locaux et d’équipement spécifiques pour cette
activité (hotte à flux laminaire vertical, cuve d’azote liquide indépendante…).
Le personnel devrait avoir bénéficié d’une formation spécifique. Lors d’une
enquête informelle réalisée récemment au BLEFCO, 18 laboratoires français d’AMP
se sont déclarés (par écrit) prêts à prendre en charge les couples sérodifférents
pour le VIH après concertation au sein de leur équipe avec les professionnels
concernés (cliniciens, techniciennes, infirmières...).
Deux protocoles sont actuellement en cours en France. Les critères d’inclusion
des patients sont très sélectifs. Entre autres critères cliniques et psychologiques,
l’AMP est réalisée avec des paillettes congelées de sperme validé en virologie.
Des techniques permettent actuellement de détecter la présence du VIH dans les
différentes fractions du sperme avec une excellente sensibilité (moins de 5
copies pour 4 millions de spermatozoïdes mobiles après sélection). La technique
d’AMP mise en œuvre est l’ICSI (Hôpital Cochin, Paris) et l’IAC (Cecos Midi-Pyrénées,
Toulouse).
Quarante-huit ICSI ont ainsi été réalisées à Cochin. Aucune séroconversion n’a
été rapportée. Le taux de grossesse était élevé, 52% (ce qui est normal chez
ces couples fertiles) mais le taux de FCS était également élevé (9 FCS sur 24
grossesses). Ce dernier point mérite confirmation sur de plus grandes séries.
On considère qu’actuellement 1000 couples sont demandeurs d’AMP.
La recherche doit se poursuivre dans plusieurs directions : localisation
du virus dans le sperme, compartimentalisation, retentissement des traitements
antirétroviraux sur la fécondance du sperme. Le suivi psychologique des couples
avant, pendant et après ne doit pas être négligé.
Il
est donc possible aujourd’hui pour ces couples sérodifférents de procréer avec
un risque minime de contamination pour la conjointe et pour l’enfant à naître
et c’est du devoir des équipes médicales de les informer de ces possibilités
et de les aider dans leur démarche.
Références
Lesourd
F., Izopet J., Mervan C., et coll. Transmissions of hepatitis C virus during
the ancillary procedures for assisted conception. Hum. Reprod., 15, 1083-1085,
2000.
Auroux M. ;
Plachot M. ; Débat : Faut-il traiter l’infertilité chez les couples
dont l’un des partenaires est séropositif ? Contracept. Fertil. Sex., 27,
118-121, 1999.
Levy R.,
Tardy J.C., Bourlet T. et coll. Risque viral lié au virus de l’hépatite C en
AMP. Andrologie, 10, 58-65, 2000.
Leruez-Ville
M., Kunstmann J.M., De Almeida M. et coll. Detection of hepatitis C virus in
the semen of infected men. The Lancet, 356, 42-43, 2000.
Marina S.,
Marina F., Alcolea R. et coll. Human immunodeficiency virus type 1-serodiscordant
couples can bear healthy children after undergoing intrauterine insemination.
Fertil. Steril.,70, 35-39, 1998.
Marina S.,
Marina F., Alcolea R. et coll. Pregnancy following intracytoplasmic sperm injection
from an HIV-1-seropositive man. Hum. Reprod., 13, 3247-3249, 1998.
Coll O.,
Vidal R., Martinez de Tejada B. et coll. Prise en charge des couples serodifférents :
le point de vue du clinicien. Contracept. Fertil. Sex., 27, 399-404, 1999.
Semprini
A.E., Levy-Setti P., Bozzo M., et coll. Insemination of HIV-negative women with
processed semen of HIV-positive partners. The Lancet, 340, 1317-1319, 1992.
Annexe
1
Protocoles
à appliquer au cours des techniques de FIV pour la manipulation des liquides
biologiques, des gamètes et des embryons susceptibles d’être infectés par le
virus de l’hépatite B ou C
J.F. Guérin
Document préparé pour les BLEFCO
POSITION
DU PROBLEME
Les
manipulations effectuées par les biologistes au cours d'une fécondation in vitro
comportent:
Le jour
de la ponction
(JO)
La recherche, sous la loupe binoculaire, des ovocytes dans le liquide de ponction
folliculaire, leur isolement dans un milieu de culture et leur mise en incubation
dans une étuve gazée, l'isolement, par lavage / centrifugation, des spermatozoïdes
à partir du sperme éjaculé et leur mise en incubation dans une étuve gazée,
l'insémination des ovocytes par les spermatozoïdes et leur mise en incubation
dans une étuve gazée.
Le lendemain de
la ponction
(Jl)
L'observation des ovocytes inséminés, la décoronisation des ovocytes sous loupe
binoculaire, le changement du milieu de culture et la remise en incubation dans
une étuve gazée.
Deux jours après
la ponction
(J2)
L'observation des embryons au microscope inversé, le chargement, sous loupe
binoculaire, des embryons sélectionnés dans un cathéter de transfert et la congélation
éventuelle des embryons surnuméraires.
Le
but du protocole décrit ci-dessous est de réduire au maximum les risques de
contamination virale du personnel qui manipule les produits infectieux ainsi
que les risques de contamination virale des gamètes et des embryons de couples
indemnes en cours de traitement au laboratoire pendant la même période ; les
précautions sanitaires d'usage étant respectées par ailleurs (évacuation des
déchets, du matériel contaminé, etc.).
Ces risques sont liés à la possibilité d'aérosolisation des liquides infectés
(sur la paillasse, dans les étuves ou au cours d'une centrifugation) ou à une
erreur de manipulation (projection d'un liquide infecté sur une personne ou
un objet).
MESURES
GENERALES
1 - Protection
du personnel
- Port
de gants étanches, d'un sarrau à manches longues (veiller à ce qu'il n'y ait
pas d'espace non couvert entre le gant et la manche), de lunettes de protection,
d'un masque chirurgical et d'un bonnet.
Au sujet des gants :
- le latex protège mieux que le chlorure de polyvinyl ou le polyéthylène
- avant de mettre des gants, recouvrir toute égratignure par un pansement
adhésif hermétique
- éviter
de passer les gants à l'alcool car ceci les perméabilise vis-à-vis de certains
microorganismes
- enlever les gants pour répondre au téléphone, travailler sur l'ordinateur,
se rendre dans une autre pièce
- lavage
des mains au savon puis à l'alcool à 70°C en fin de manipulation
- ne pas
travailler sous hotte à flux laminaire horizontal, utiliser une paillasse
« ouverte » ou une enceinte fermée, à proximité d'une flamme
- ne pas
rester à proximité des centrifugeuses pendant quelles fonctionnent
- la vaccination
contre l'hépatite « B » doit, par ailleurs, être à jour
Autres mesures
de protection
- éviter
de porter les mains au visage ou aux yeux
- ne jamais
pipeter à la bouche
- éviter
l'utilisation d'objets piquants ou tranchants (attention aux pipettes en verre
effilées)
- utiliser
de préférence les centrifugeuses ayant un capuchon pour les nacelles
- la centrifugation
sera toujours effectuée dans des tubes fermés, l'équilibrage autour du rotor
sera effectué avec de l'eau dans des tubes identiques que l'on fermera
- ne pas
laisser sortir de matériel ou produit biologique contaminé hors du laboratoire
2 - Protection des gamètes
et des embryons de couples indemnes en cours de traitement au laboratoire pendant
la même période
Afin
que les prélèvements sains et contaminés ne puissent pas se trouver à proximité
l'un de l'autre, il convient :
- de dissocier les prélèvements et les manipulations dans le temps : la ponction,
le traitement du sperme, l'observation à Jl et le transfert des embryons doivent
être effectués après que le traitement des gamètes ou des embryons de patients
non porteurs soit achevé ; les ponctions folliculaires de femmes porteuses doivent
donc être programmées en dernier
- de cultiver les gamètes et les embryons contaminés (ou considérés comme tels)
dans une étuve indépendante
- deux couples « à risque » ne peuvent pas être pris en charge dans la même
journée. Il faut donc espacer les ponctions de 2 jours entre 2 couples « à risque
» (temps nécessaire pour aller de l'insémination au transfert).
Tous les matériels en contact direct avec les prélèvements (seringues, embouts
de pipetage, pipettes, tubes à centrifuger, boites de cultures) sont à usage
unique et jetés immédiatement après usage dans des conteneurs ad hoc évacués
à la fin des manipulations.
En dehors de projections accidentelles de liquides contaminés, les statifs des
loupes et des microscopes, les étuves, sont décontaminés par un désinfectant
virucide (type «SURFANIOS»); les surfaces de travail sont décontaminées à l'eau
de javel 12°C chlorométrique à la fin des manipulations. Les sols et le mobilier
sont nettoyés à l'Hexanios.
MANIPULATIONS
DES SPERMES INFECTES
Les
spermes doivent être traités un par un, sous hotte à flux vertical si possible,
qui sera nettoyée entre chaque patient. Après liquéfaction, le sperme sera centrifugé
sur gradient de densité. Il est recommandé de ne pas toucher les parois des
tubes proches de leur extrémité, avec la pointe ou l'embout de la pipette. Le
fait de travailler sous une couche d'huile augmente la sécurité. Le lavage de
la fraction la plus concentrée du gradient de densité, qui sera utilisée pour
l'AMP, s'effectuera en respectant les mêmes précautions.
Prélèvement
des aliquots pour recherche de l'ARN viral
Un volume
minimum de 0,2 ml correspondant respectivement : au sperme «total» après liquéfaction,
à la fraction 90 ou 100% du gradient de densité utilisé pour l'AMP, et à la
fraction supérieure du gradient (en général : 40-50%), sera congelé à – 30°C
ou mieux à – 80°C. Les tubes peuvent être placés directement dans le congélateur,
l'objectif étant d'effectuer ultérieurement une recherche d'ARN viral, et non
de préserver la viabilité des spermatozoïdes. A – 30°C, la conservation ne pourra
excéder 3 mois. Au moment du transfert, un aliquot du milieu de culture embryonnaire
sera prélevé et congelé dans les mêmes conditions.
Deux stratégies sont possibles :
- soit
le laboratoire d'AMP suit à la lettre le protocole multicentrique tel qu'il
a été présenté au CCPPRB : les aliquots sont congelés pour attendre un ramassage
collectif. ils ne seront analysés qu'en cas d'augmentation de l'incidence
des contaminations du conceptus, donc dans tous les cas bien plus tard. L'AMP
est donc effectuée sans connaître les résultats
- soit
le laboratoire d'AMP décide de jouer la prudence « maximale », auquel cas
il devra congeler la fraction destinée à l'AMP, en respectant cette fois les
procédures classiques relatives à la congélation des spermatozoïdes, afin
de préserver au mieux leur viabilité et leur mobilité.
MANIPULATION
DES LIQUIDES FOLLICULAIRES INFECTES
On
demandera au gynécologue d'éviter au maximum de contaminer par du sang les prélèvements
de liquides folliculaires. Les prélèvements jugés trop sanglants pourront être
écartés, et la recherche de complexes cumulo-ovocytaires (CCO) non effectuée
dans ceux-ci. Il est conseillé de rechercher les CCO à l'oeil nu, sous hotte
à flux vertical : les CCO ainsi collectés seront rincés dans plusieurs bains
successifs de milieu de culture ovocytaire. Il est conseillé de travailler sous
huile, afin de réduire les risques d'aérosolisation directe. A la fin de la
série de lavages, les CCO sont transférés dans une ou plusieurs boites de cultures,
contenant du milieu également sous huile, et examinés sous loupe afin de confirmer
la présence de l'ovocyte.
Prélèvement
des aliquots pour recherche de l'ARN viral
Les
prélèvements suivants seront congelés dans un congélateur à – 70°C :
- fluides
folliculaires poolés (0,5 ml)
- milieu
d'incubation des ovocytes avant fécondation, poolés (0,5 ml)
- milieu
de culture au moment du transfert, poolés (0,5 ml)
CONGELATION
DES EMBRYONS SURNUMERAIRES
Dans
la mesure où ces embryons sont issus de patients à risque viral, il est recommandé
d' utiliser des paillettes haute sécurité ; pour éviter tout risque de contamination
des paillettes
non à risque, il serait souhaitable de pouvoir les stocker dans une cuve d'azote
liquide
réservée à ces cas.
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