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Titre: Coculture, eclosion assistee - vrai ou faux progres ?
Année: 1996
Auteurs: - Plachot M.
Spécialité: Biologie
Theme: FIV

coculture, éclosion assistée 
vrai ou faux progrès?

M. PLACHOT

L'échec d'implantation après fécondation in vitro (FIV) peut être d'origine maternelle ou embryonnaire. Ainsi, en cas d'échecs répétés d'implantation malgré le transfert de plusieurs embryons morphologiquement normaux, 2 techniques peuvent être proposées, dont l'efficacité est encore en cours d'évaluation : la coculture et l'éclosion assistée.

LA COCULTURE

Les milieux de culture traditionnels utilisés en France dans le cadre de la fécondation in vitro (FIV) (B2, IVF Medicult), efficaces pour le développement de l'embryon humain précoce (80 % des œufs fécondés parviennent au stade 8 cellules) se sont révélés peu performants pour une culture prolongée puisque seulement 3 % des embryons atteignent le stade blastocyste 5 ou 6 jours après l'insémination (JO). Si l'obtention d'une grossesse est la résultante d'une viabilité embryonnaire et d'une réceptivité utérine optimales, l'échec d'implantation peut être dû en partie à des conditions de culture suboptimales.

La coculture, c'est-à-dire la culture d'un embryon sur un tapis cellulaire a été réalisée pour la première fois chez l'homme en 1989 après que de nombreuses études aient prouvé chez l'animal dès 1962 que cette technique améliorait le taux d'embryons parvenant au stade blastocyste et que " l'effet coculture " n'était pas spécifique de l'espèce et ne nécessitait pas la présence de cellules du tractus génital. Les résultats spectaculaires observés chez l'animal ont donc incité plusieurs équipes de FIV à initier un protocole clinique dans le but de sélectionner les embryons ayant les meilleures potentialités de développement et d'obtenir une meilleure synchronie entre l'endomètre et l'embryon (pour revue, Plachot, 1995).

Globalement, deux paramètres sont à prendre en compte : la durée de la coculture, et l'origine du tapis cellulaire.

La durée de la coculture peut varier de 1 jour (transfert des embryons au stade 2-4 cellules) à 5 jours (transfert de blastocytes expansés). Il est maintenant clairement démontré que le nombre d'embryons capables de se diviser diminue avec la durée de la culture, ceux parvenant au stade de blastocyste expansé étant " sélectionnés " par rapport aux œufs fécondés mis en coculture. En moyenne (et suivant l'indication pour FIV) 30 à 60 % des embryons parviennent au stade de blastocyste et peuvent être transférés ou congelés. Le taux de grossesse dépend de la vitesse du développement, le meilleur taux étant obtenu après transfert de blastocystes expansés à J5 (41 %/transfert). Enfin, les blastocytes surnuméraires peuvent être congelés. Le taux de grossesses après transfert de blastocystes congelés - décongelés : 13,9 % (Olivennes et coll., 1994), 17,8 % (Janny et coll., 1993) est identique à celui obtenu après transfert d'embryons de 2 à 8 cellules (15%) (Mandelbaulm et coll., 1994).Plusieurs tapis cellulaires ont été testés : les cellules de la granulosa humaine, les cellules épithéliales tubaires ou endométriales humaines, les cellules d'oviducte de bovins et les cellules épithéliales de rein de singe (Vero).

Il semble que le type de tapis cellulaire n'a que peu ou pas d'effet sur le développement et la viabilité embryonnaires lesquels sont de toute façon améliorés en coculture par rapport aux témoins (sans coculture), mais que le facteur limitant principal est l'indication pour FIV. Ainsi, il convient de distinguer les couples dits " tout venant " et donc non sélectionnés, de ceux sélectionnés pour une coculture car présentant de multiples échecs d'implantation et/ou un âge maternel élevé (> 40 ans), des embryons répétitivement fragmentés...Ce sont incontestablement les cellules de rein de singe (Vero) qui remportent l'adhésion des biologistes de FIV puisque 9 études ont été rapportées au cours de ces 2 dernières années. Trois sont randomisées et ont inclus les patientes tout-venant : aucune ne montre d'amélioration statistique du taux de grossesse. En revanche plusieurs séries (avec ou sans témoin) présentent de bons résultats chez des couples ayant des échecs répétés d'implantation.

Ainsi Olivennes et coll (1994) montrent que le taux de grossesse/transfert dépend de l'indication : 37,2 % chez les couples ayant soit 4 échecs d'implantation soit au moins10 embryons morphologiquement normaux transférés, 36,3 % chez les patientes ayant un utérus malformé (transfert d'un seul blastocyste), 13 % chez les couples pour lesquels il est nécessaire d'évaluer le développement embryonnaire (problème de qualité ovocytaire, FSH élevée, patientes âgées), et 13,6 % après transfert de blastocystes congelés.Une étude intéressante a été rapportée par Janny et coll (1993). Alors qu'ils n'observent aucune amélioration du taux de grossesse après coculture chez des couples tout venant dans une série randomisée (31,4 %/transfert vs 30,3 %), ils rapportent un taux de grossesse élevé (42 %/transfert) chez des couples présentant au moins 4 échecs d'implantation. Une étude randomisée serait là aussi souhaitable de manière à mieux cibler les indications pour lesquelles la coculture aurait une réelle efficacité. Les auteurs montrent également un effet de la qualité du sperme sur le développement embryonnaire. Ainsi, alors que 44,4 % des œufs fécondés se développent jusqu'en blastocyste lorsque le sperme est normal, le taux décroît et atteint 34,4 % en cas de sperme congelé de donneur et 34,6 % en cas de sperme altéré. Il se pourrait qu'une asynchronie dans le développement des pronuclei, avec un retard de croissance du pronucleus mâle après utilisation de sperme congelé ou altéré, induise une diminution de la viabilité embryonnaire in vitro.Nous avons initié un protocole de coculture en 1991, en utilisant tout d'abord un tapis cellulaire composé de cellules de la granulosa autologues, puis nous avons testé les cellules endométriales autologues et les cellules Vero (Plachot, 1995). Les cellules Vero utilisées provenaient de l'OMS et pouvaient donc être utilisées dans un protocole clinique.

Entre janvier et septembre 1995 (les autres séries ayant déjà été publiées), 21 couples ont été inclus dans notre protocole de coculture à l'hôpital Tenon (Pr Salat-Baroux). Ces patientes avaient eu en moyenne 6,8 transferts antérieurs d'embryons frais ou congelés (2 à 16) sans grossesse. L'âge maternel moyen était de 36,6 ans (26 à 43 ans), c'est-à-dire plus élevé que l'âge moyen des patientes entrant dans un protocole de FIV (33,7 ans, FIVNAT). Quatre- vingt-seize zygotes ont été mis en coculture à J1 (JO étant le jour de la ponction). Cinquante- trois blastocystes ont été obtenus (55 %). Seize patientes ont eu un transfert de 1 à 3 blastocystes et 5 ont obtenu une grossesse ; le taux de grossesse dans cette série est donc de 31,3 %/transfert et 23,8 %/coculture. Cinq patientes n'ont donc pas eu de transfert à cause d'un échec du développement embryonnaire lors de la coculture. Deux de ces patientes avaient 42 et 43 ans et les 3 autres avaient eu des échecs du développement embryonnaire sur les tentatives précédentes. Huit patientes ont eu des blastocystes surnuméraires congelés ; à ce jour ils n'ont pas encore été décongelés. Dans les séries précédentes 2 grossesses avaient été obtenues après 7 transferts de blastocystes congelés-décongelés (28,6 %/transfert).

Le BLEFCO (Fédération des biologistes des laboratoires pour l'étude de la fécondation et de la conservation de l'œuf) a rapporté récemment les résultats d'une enquête nationale sur les cocultures. (GEFF-BLEFCO, 1995). C'est le plus important bilan jamais publié sur ce sujet puisqu'il concerne 1 603 tentatives de coculture réalisées dans 16 centres de FIV français en 1993-1994. La plupart des équipes (11/16) utilisent les cellules VERO.

Les indications des cocultures sont par ordre décroissant de fréquence :

- échecs successifs d'implantation ³ 3

- désir ou nécessité d'éviter les grossesses de haut rang

- âge maternel élevé (38 ans ou plus)

- embryons de mauvaise qualité à J2, qui subiront un transfert différé à J5-J6, avec congélation éventuelle des embryons surnuméraires

- risque d'hyperstimulation- embryons surnuméraires de mauvaise qualité à J2, pour congélation éventuelle à J5-J7- congélation systématique des embryons surnuméraires au stade blastocyste pour limiter le stock d'embryons congelés.

Les résultats de cette enquête montrent que 41.8 % des œufs fécondés mis en coculture se développent jusqu'au stade blastocyste. Le taux de grossesses cliniques/transfert (32,9 %) et le taux d'implantation/blastocyste (24,8 %) sont élevés, compte tenu du mauvais pronostic de nombre de ces patientes. Alors que la sélection des embryons au stade blastocyste devait diminuer le nombre d'embryons transférés et par voie de conséquence le taux de grossesses multiples on s'aperçoit qu'il n'en est rien puisque 29,1 % des grossesses comportent 2 fœtus ou plus. Ce taux va sûrement décroître maintenant que le système a fait ses preuves avec un taux d'implantation élevé qui incitera les biologistes et les cliniciens à la prudence. Le taux d'interruption spontanée de grossesse est modéré, 15,9 %. Onze anomalies/510 fœtus ou enfants nés ont été détectées au cours de la grossesse ou à la naissance (2,3 %) : polymalformation, anencéphalie, hydrocéphalie, trisomie 18 et 21. Ce taux est identique à celui rapporté après FIV classique ou même après fécondation naturelle. Les 6 trisomies s'expliquent par l'âge élevé des patientes : 37,6 ans en moyenne.

Ces résultats montrent que la coculture peut être proposée à des couples ayant eu plusieurs échecs d'implantation. Elle a un rôle diagnostique (en cas d'échec du développement embryonnaire) et thérapeutique puisque dans notre petite série (non randomisée) ainsi que pour certains auteurs, l'efficacité semble supérieure à celle de la FIV classique. Elle permet parmi les embryons surnuméraires (quelle que soit leur morphologie) de sélectionner les embryons viables et de les congeler au stade blastocyste. Enfin, les blastocystes congelés ont un taux d'implantation élevé. Coculture et congélation des blastocystes représentent donc un complément intéressant à la FIV classique.

L'éCLOSION ASSISTéE

L'éclosion assistée consiste en la réalisation d'une brèche dans la zone pellucide de l'embryon au 2e ou 3e jour après l'insémination, juste avant le transfert in utero, de manière à favoriser l'éclosion de l'embryon in vivo (vers le 7e jour) et son implantation (Pour revue, Olivennes et coll, 1995).En effet, Cohen et al (1989) ont observé que les embryons dont la zone pellucide est d'épaisseur variable (75 % des embryons) s'implantent mieux (taux d'implantation 29 %) que ceux dont la zone pellucide est uniforme (taux d'implantation 10 %). Ces variations de l'épaisseur de la zona facilitent les échanges entre le milieu environnant et l'embryon et sont la preuve de la réponse de la zona aux actions enzymatiques (lysines). D'où l'idée que des anomalies de la zona pourraient être à l'origine d'anomalies de l'éclosion, et que la réalisation d'une brèche dans la zona pourrait faciliter l'éclosion.

Plusieurs méthodes ont été testées :- mécanique (Partial Zona dissection, PZD) : technique facile, peu agressive pour l'embryon ;- chimique (Zona drilling) : la zone pellucide est dissoute localement par du tyrode acide (pH 2.5) ; cette méthode est simple mais il existe un risque de toxicité du tyrode acide ;- au laser : méthode onéreuse mais dont l'agressivité est limitée ;- amincissement mécanique ou chimique : peu efficace.

L'efficacité de l'éclosion assistée a été évaluée expérimentalement par Mandelbaum et coll (1994). Les embryons congelés à J2 et donnés par les couples à la recherche ont été décongelés et partagés en 2 groupes : éclosion assistée (par dissection partielle de la zona) et témoin. Les 2 groupes d'embryons ont été cultivés sur cellules Vero jusqu'à J6. Les résultats ont montré que le taux d'embryons parvenant au stade blastocyste était identique dans les 2 groupes (32 %) et que le taux d'éclosion était beaucoup plus élevé chez les embryons micromanipulés que chez les témoins : 100 % VS 33 %, respectivement.

L'éclosion assistée n'a que peu d'efficacité chez les patientes (et embryons) tout venant. Dans une série randomisée, Cohen et coll (1992) obtiennent un taux d'implantation de 28 % et 21 % par embryon micromanipulé et témoin, respectivement. En revanche, l'éclosion assistée sur des embryons sélectionnés (car ayant de faibles chances d'implantation) ou chez des couples sélectionnés (car ayant un mauvais pronostic en FIV) semble donner de bons résultats. Ainsi, l'éclosion assistée sélective lorsque la zone pellucide a plus de 15 µm d'épaisseur, ou l'embryon moins de 5 cellules à J3 ou encore lorsqu'il a plus de 20 % de fragments, améliore le taux d'implantation, 25 % par embryon (vs 18 % chez les témoins, p<0.01). L'éclosion assistée augmente les chances d'implantation chez les patientes ayant une FSH élevée, 26 % VS 10 % (Cohen et coll, 1992).

L'éclosion assistée au laser a été proposée à des couples ayant eu en moyenne 3,3 échecs d'implantation et 10 embryons transférés in utero. Le taux de grossesses évolutives par transfert est meilleur après éclosion assistée et varie de 12,5 % à 41,9 % en fonction du nombre d'embryons transférés (1 à 5) vs 6.3 % à 13,7 % chez les témoins, respectivement. Quarante quatre enfants sont nés après éclosion assistée dans cette équipe, tous normaux (Obruca et coll, 1994).Les résultats français de l'éclosion assistée sont moins spectaculaires. Olivennes et coll (1994) obtiennent un taux de grossesse par transfert de 24,3 % chez les patientes ayant eu4 transferts de 3 embryons sans grossesse évolutive, et 22,2 % pour les patientes de plus de 38 ans (âge moyen : 41 ans). Ces résultats semblent se confirmer au long cours, principalement pour les patientes âgées. Les auteurs insistent sur le rôle joué par l'entraînement du personnel sur l'efficacité de la méthode.

Nous avons proposé une éclosion embryonnaire assistée aux patientes ayant eu (comme pour les cocultures) plusieurs échecs d'implantation et/ou ayant plus de 38 ans. Cette technique était souvent proposée après échec de la coculture. Il s'agissait donc de patientes ayant un très mauvais pronostic. L'éclosion assistée était réalisée à l'hôpital Necker sur des embryons provenant de patientes de l'hôpital Tenon, l'hôpital de Sèvres et la clinique de La Muette. Soixante quatorze patientes ont bénéficié de cette technique. En moyenne2,6 embryons ont été transférés et 8 patientes ont obtenu une grossesse. Le taux de grossesse global par transfert est faible (11 %) et varie suivant les centres, le nombre d'embryons transférés et l'indication : de 0 à 17 % (Mandelbaum, communication personnelle). Ainsi, chez ces patientes ayant souvent de multiples échecs d'implantation, un âge avancé, des anomalies du développement embryonnaire et un (ou plusieurs échecs de coculture) le bénéfice de cette technique est modeste (voire nul).Il est également possible de combiner coculture et éclosion assistée. Ainsi Tucker et coll (1994) ont inclus dans un protocole randomisé 100 patientes ayant, soit au moins 38 ans, soit de multiples échecs antérieurs d'implantation ; le taux de débuts de grossesse (b hCG positifs) et le taux d'implantation par embryon étaient plus élevés après coculture (42 heures sur cellules d'oviducte de bovins) + éclosion assistée (à J3 avant le transfert in utero) qu'après éclosion assistée seule (52 % vs 32 %) et (18 % vs 10 %), respectivement. Il y aurait donc un effet cumulatif de ces 2 techniques. La coculture favoriserait l'activation du génome embryonnaire et le métabolisme de l'embryon alors que l'éclosion assistée permettrait de dépasser les anomalies de la zone pellucide. Il est dommage que les auteurs n'aient pas comparé ces résultats à ceux de la coculture seule laquelle agit également sur l'amincissement de la zone pellucide et donc sur l'éclosion.

LES RISQUES DES NOUVELLES TECHNOLOGIES

Il est clair que toute innovation technique doit satisfaire à 2 critères : efficacité et innocuité. Si l'efficacité est encore en cours d'évaluation, l'innocuité doit être démontrée très rapidement. Or les cocultures ne sont pas dénuées de risques et en tout premier lieu de risque infectieux, et cela à 2 niveaux : à l'origine (contrôles réalisés chez le fournisseur) et au cours de la culture (au laboratoire). Le risque d'incorporation de germes pathogènes augmente avec la durée de la culture et le nombre de réensemencements successifs, en particulier pour les mycoplasmes et les virus. Il est donc impératif de faire contrôler les sous-cultures dans un laboratoire spécialisé ou bien de réaliser des cultures courtes (5 à 6 jours maximum) à partir de cellules souches congelées et dûment contrôlées. L'utilisation de cellules autologues (granulosa, endomètre) ou de cellules Vero de l'OMS (à usage clinique) diminue le risque d'infection primitive mais laisse entier le risque d'infection de la culture au laboratoire. Il est donc considéré par les virologues comme dangereux de cumuler éclosion assistée puis coculture car la protection assurée par la zone pellucide devient dans ce cas caduque.

L'éclosion assistée induit des risques spécifiques :

- perte de la protection de l'embryon par la zone pellucide 2 à 3 jours plus tôt que le moment habituel, pouvant provoquer in vivo une infection et l'invasion par les leucocytes ;

- anomalies de l'éclosion dues à une brèche trop petite, pouvant aller de la formation de jumeaux monozygotes à l'absence complète d'éclosion. Actuellement on ne note pas d'augmentation du taux de jumeaux monozygotes chez ces couples.

CONCLUSION

Les cocultures permettent aujourd'hui (moyennant un important surcroît de travail au laboratoire) d'obtenir des grossesses après FIV à un taux au moins égal à celui obtenu par les techniques standard. Elles permettent également de proposer à des couples ayant de faibles chances de procréer après de nombreux échecs d'implantation, une technique nouvelle motivante mais dont la supériorité (par rapport aux techniques classiques) n'est pas encore totalement démontrée. Elles ont une finalité diagnostique : les couples pour qui le développement embryonnaire s'arrête répétitivement avant le stade blastocyste ont de très faibles chances de grossesse. Elles permettent de sélectionner parmi les embryons surnuméraires ceux qui atteignent le stade de blastocyste et donc ont de meilleures chances d'implantation, diminuant ainsi le nombre d'embryons congelés et stockés. Elles permettent de transférer 1 seul embryon (sélectionné) chez les couples pour qui une grossesse multiple est non désirée ou médicalement déconseillée.

Il n'existe aujourd'hui aucune preuve que l'éclosion assistée améliore réellement les chances d'implantation. Pourtant il est vraisemblable que chez certaines patientes, l'échec d'implantation soit lié à un échec d'éclosion (zone pellucide épaisse ou résistante). Il est actuellement impossible d'identifier ces patientes. Des études randomisées et ciblées seront nécessaires avant d'affirmer la réelle efficacité de cette technique.

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M. PLACHOT** Laboratoire de Fécondation in Vitro et Biologie de la Reproduction, Hôpital Necker, 149, rue de Sèvres, 75015 Paris.  : JOURNÉES DE TECHNIQUES AVANCÉES EN GYNÉCOLOGIE OBSTÉTRIQUE ET PÉRINATALOGIE PMA, Fort de France 11 - 18 janvier 1996