coculture, éclosion assistée
vrai ou faux progrès?
M. PLACHOT
L'échec d'implantation après fécondation
in vitro (FIV) peut être d'origine maternelle ou embryonnaire.
Ainsi, en cas d'échecs répétés d'implantation
malgré le transfert de plusieurs embryons morphologiquement
normaux, 2 techniques peuvent être proposées, dont
l'efficacité est encore en cours d'évaluation :
la coculture et l'éclosion assistée.
LA COCULTURE
Les milieux de culture traditionnels utilisés en France
dans le cadre de la fécondation in vitro (FIV) (B2, IVF
Medicult), efficaces pour le développement de l'embryon
humain précoce (80 % des ufs fécondés
parviennent au stade 8 cellules) se sont révélés
peu performants pour une culture prolongée puisque seulement
3 % des embryons atteignent le stade blastocyste 5 ou 6 jours
après l'insémination (JO). Si l'obtention d'une
grossesse est la résultante d'une viabilité embryonnaire
et d'une réceptivité utérine optimales, l'échec
d'implantation peut être dû en partie à des
conditions de culture suboptimales.
La coculture, c'est-à-dire la culture d'un embryon sur
un tapis cellulaire a été réalisée
pour la première fois chez l'homme en 1989 après
que de nombreuses études aient prouvé chez l'animal
dès 1962 que cette technique améliorait le taux
d'embryons parvenant au stade blastocyste et que " l'effet
coculture " n'était pas spécifique de l'espèce
et ne nécessitait pas la présence de cellules du
tractus génital. Les résultats spectaculaires observés
chez l'animal ont donc incité plusieurs équipes
de FIV à initier un protocole clinique dans le but de sélectionner
les embryons ayant les meilleures potentialités de développement
et d'obtenir une meilleure synchronie entre l'endomètre
et l'embryon (pour revue, Plachot, 1995).
Globalement, deux paramètres sont à prendre en
compte : la durée de la coculture, et l'origine du
tapis cellulaire.
La durée de la coculture peut varier de 1 jour (transfert
des embryons au stade 2-4 cellules) à 5 jours (transfert
de blastocytes expansés). Il est maintenant clairement
démontré que le nombre d'embryons capables de se
diviser diminue avec la durée de la culture, ceux parvenant
au stade de blastocyste expansé étant " sélectionnés
" par rapport aux ufs fécondés mis en
coculture. En moyenne (et suivant l'indication pour FIV) 30 à
60 % des embryons parviennent au stade de blastocyste et peuvent
être transférés ou congelés. Le taux
de grossesse dépend de la vitesse du développement,
le meilleur taux étant obtenu après transfert de
blastocystes expansés à J5 (41 %/transfert). Enfin,
les blastocytes surnuméraires peuvent être congelés.
Le taux de grossesses après transfert de blastocystes congelés
- décongelés : 13,9 % (Olivennes et coll., 1994),
17,8 % (Janny et coll., 1993) est identique à celui obtenu
après transfert d'embryons de 2 à 8 cellules (15%)
(Mandelbaulm et coll., 1994).Plusieurs tapis cellulaires ont été
testés : les cellules de la granulosa humaine, les cellules
épithéliales tubaires ou endométriales humaines,
les cellules d'oviducte de bovins et les cellules épithéliales
de rein de singe (Vero).
Il semble que le type de tapis cellulaire n'a que peu ou pas d'effet
sur le développement et la viabilité embryonnaires
lesquels sont de toute façon améliorés en
coculture par rapport aux témoins (sans coculture), mais
que le facteur limitant principal est l'indication pour FIV. Ainsi,
il convient de distinguer les couples dits " tout venant "
et donc non sélectionnés, de ceux sélectionnés
pour une coculture car présentant de multiples échecs
d'implantation et/ou un âge maternel élevé
(> 40 ans), des embryons répétitivement fragmentés...Ce
sont incontestablement les cellules de rein de singe (Vero) qui
remportent l'adhésion des biologistes de FIV puisque 9
études ont été rapportées au cours
de ces 2 dernières années. Trois sont randomisées
et ont inclus les patientes tout-venant : aucune ne montre d'amélioration
statistique du taux de grossesse. En revanche plusieurs séries
(avec ou sans témoin) présentent de bons résultats
chez des couples ayant des échecs répétés
d'implantation.
Ainsi Olivennes et coll (1994) montrent que le taux de grossesse/transfert
dépend de l'indication : 37,2 % chez les couples ayant
soit 4 échecs d'implantation soit au moins10 embryons morphologiquement
normaux transférés, 36,3 % chez les patientes ayant
un utérus malformé (transfert d'un seul blastocyste),
13 % chez les couples pour lesquels il est nécessaire d'évaluer
le développement embryonnaire (problème de qualité
ovocytaire, FSH élevée, patientes âgées),
et 13,6 % après transfert de blastocystes congelés.Une
étude intéressante a été rapportée
par Janny et coll (1993). Alors qu'ils n'observent aucune amélioration
du taux de grossesse après coculture chez des couples tout
venant dans une série randomisée (31,4 %/transfert
vs 30,3 %), ils rapportent un taux de grossesse élevé
(42 %/transfert) chez des couples présentant au moins 4
échecs d'implantation. Une étude randomisée
serait là aussi souhaitable de manière à
mieux cibler les indications pour lesquelles la coculture aurait
une réelle efficacité. Les auteurs montrent également
un effet de la qualité du sperme sur le développement
embryonnaire. Ainsi, alors que 44,4 % des ufs fécondés
se développent jusqu'en blastocyste lorsque le sperme est
normal, le taux décroît et atteint 34,4 % en cas
de sperme congelé de donneur et 34,6 % en cas de sperme
altéré. Il se pourrait qu'une asynchronie dans le
développement des pronuclei, avec un retard de croissance
du pronucleus mâle après utilisation de sperme congelé
ou altéré, induise une diminution de la viabilité
embryonnaire in vitro.Nous avons initié un protocole de
coculture en 1991, en utilisant tout d'abord un tapis cellulaire
composé de cellules de la granulosa autologues, puis nous
avons testé les cellules endométriales autologues
et les cellules Vero (Plachot, 1995). Les cellules Vero utilisées
provenaient de l'OMS et pouvaient donc être utilisées
dans un protocole clinique.
Entre janvier et septembre 1995 (les autres séries ayant
déjà été publiées), 21 couples
ont été inclus dans notre protocole de coculture
à l'hôpital Tenon (Pr Salat-Baroux). Ces patientes
avaient eu en moyenne 6,8 transferts antérieurs d'embryons
frais ou congelés (2 à 16) sans grossesse. L'âge
maternel moyen était de 36,6 ans (26 à 43 ans),
c'est-à-dire plus élevé que l'âge moyen
des patientes entrant dans un protocole de FIV (33,7 ans, FIVNAT).
Quatre- vingt-seize zygotes ont été mis en coculture
à J1 (JO étant le jour de la ponction). Cinquante-
trois blastocystes ont été obtenus (55 %). Seize
patientes ont eu un transfert de 1 à 3 blastocystes et
5 ont obtenu une grossesse ; le taux de grossesse dans cette série
est donc de 31,3 %/transfert et 23,8 %/coculture. Cinq patientes
n'ont donc pas eu de transfert à cause d'un échec
du développement embryonnaire lors de la coculture. Deux
de ces patientes avaient 42 et 43 ans et les 3 autres avaient
eu des échecs du développement embryonnaire sur
les tentatives précédentes. Huit patientes ont eu
des blastocystes surnuméraires congelés ; à
ce jour ils n'ont pas encore été décongelés.
Dans les séries précédentes 2 grossesses
avaient été obtenues après 7 transferts de
blastocystes congelés-décongelés (28,6 %/transfert).
Le BLEFCO (Fédération des biologistes des laboratoires
pour l'étude de la fécondation et de la conservation
de l'uf) a rapporté récemment les résultats
d'une enquête nationale sur les cocultures. (GEFF-BLEFCO,
1995). C'est le plus important bilan jamais publié sur
ce sujet puisqu'il concerne 1 603 tentatives de coculture réalisées
dans 16 centres de FIV français en 1993-1994. La plupart
des équipes (11/16) utilisent les cellules VERO.
Les indications des cocultures sont par ordre décroissant
de fréquence :
- échecs successifs d'implantation ³ 3
- désir ou nécessité d'éviter les
grossesses de haut rang
- âge maternel élevé (38 ans ou plus)
- embryons de mauvaise qualité à J2, qui subiront
un transfert différé à J5-J6, avec congélation
éventuelle des embryons surnuméraires
- risque d'hyperstimulation- embryons surnuméraires de
mauvaise qualité à J2, pour congélation éventuelle
à J5-J7- congélation systématique des embryons
surnuméraires au stade blastocyste pour limiter le stock
d'embryons congelés.
Les résultats de cette enquête montrent que 41.8
% des ufs fécondés mis en coculture se développent
jusqu'au stade blastocyste. Le taux de grossesses cliniques/transfert
(32,9 %) et le taux d'implantation/blastocyste (24,8 %) sont élevés,
compte tenu du mauvais pronostic de nombre de ces patientes. Alors
que la sélection des embryons au stade blastocyste devait
diminuer le nombre d'embryons transférés et par
voie de conséquence le taux de grossesses multiples on
s'aperçoit qu'il n'en est rien puisque 29,1 % des grossesses
comportent 2 ftus ou plus. Ce taux va sûrement décroître
maintenant que le système a fait ses preuves avec un taux
d'implantation élevé qui incitera les biologistes
et les cliniciens à la prudence. Le taux d'interruption
spontanée de grossesse est modéré, 15,9 %.
Onze anomalies/510 ftus ou enfants nés ont été
détectées au cours de la grossesse ou à la
naissance (2,3 %) : polymalformation, anencéphalie, hydrocéphalie,
trisomie 18 et 21. Ce taux est identique à celui rapporté
après FIV classique ou même après fécondation
naturelle. Les 6 trisomies s'expliquent par l'âge élevé
des patientes : 37,6 ans en moyenne.
Ces résultats montrent que la coculture peut être
proposée à des couples ayant eu plusieurs échecs
d'implantation. Elle a un rôle diagnostique (en cas d'échec
du développement embryonnaire) et thérapeutique
puisque dans notre petite série (non randomisée)
ainsi que pour certains auteurs, l'efficacité semble supérieure
à celle de la FIV classique. Elle permet parmi les embryons
surnuméraires (quelle que soit leur morphologie) de sélectionner
les embryons viables et de les congeler au stade blastocyste.
Enfin, les blastocystes congelés ont un taux d'implantation
élevé. Coculture et congélation des blastocystes
représentent donc un complément intéressant
à la FIV classique.
L'éCLOSION ASSISTéE
L'éclosion assistée consiste en la réalisation
d'une brèche dans la zone pellucide de l'embryon au 2e
ou 3e jour après l'insémination, juste avant le
transfert in utero, de manière à favoriser l'éclosion
de l'embryon in vivo (vers le 7e jour) et son implantation (Pour
revue, Olivennes et coll, 1995).En effet, Cohen et al (1989) ont
observé que les embryons dont la zone pellucide est d'épaisseur
variable (75 % des embryons) s'implantent mieux (taux d'implantation
29 %) que ceux dont la zone pellucide est uniforme (taux d'implantation
10 %). Ces variations de l'épaisseur de la zona facilitent
les échanges entre le milieu environnant et l'embryon et
sont la preuve de la réponse de la zona aux actions enzymatiques
(lysines). D'où l'idée que des anomalies de la zona
pourraient être à l'origine d'anomalies de l'éclosion,
et que la réalisation d'une brèche dans la zona
pourrait faciliter l'éclosion.
Plusieurs méthodes ont été testées
:- mécanique (Partial Zona dissection, PZD) : technique
facile, peu agressive pour l'embryon ;- chimique (Zona drilling)
: la zone pellucide est dissoute localement par du tyrode acide
(pH 2.5) ; cette méthode est simple mais il existe un risque
de toxicité du tyrode acide ;- au laser : méthode
onéreuse mais dont l'agressivité est limitée
;- amincissement mécanique ou chimique : peu efficace.
L'efficacité de l'éclosion assistée a été
évaluée expérimentalement par Mandelbaum
et coll (1994). Les embryons congelés à J2 et donnés
par les couples à la recherche ont été décongelés
et partagés en 2 groupes : éclosion assistée
(par dissection partielle de la zona) et témoin. Les 2
groupes d'embryons ont été cultivés sur cellules
Vero jusqu'à J6. Les résultats ont montré
que le taux d'embryons parvenant au stade blastocyste était
identique dans les 2 groupes (32 %) et que le taux d'éclosion
était beaucoup plus élevé chez les embryons
micromanipulés que chez les témoins : 100 % VS 33
%, respectivement.
L'éclosion assistée n'a que peu d'efficacité
chez les patientes (et embryons) tout venant. Dans une série
randomisée, Cohen et coll (1992) obtiennent un taux d'implantation
de 28 % et 21 % par embryon micromanipulé et témoin,
respectivement. En revanche, l'éclosion assistée
sur des embryons sélectionnés (car ayant de faibles
chances d'implantation) ou chez des couples sélectionnés
(car ayant un mauvais pronostic en FIV) semble donner de bons
résultats. Ainsi, l'éclosion assistée sélective
lorsque la zone pellucide a plus de 15 µm d'épaisseur,
ou l'embryon moins de 5 cellules à J3 ou encore lorsqu'il
a plus de 20 % de fragments, améliore le taux d'implantation,
25 % par embryon (vs 18 % chez les témoins, p<0.01).
L'éclosion assistée augmente les chances d'implantation
chez les patientes ayant une FSH élevée, 26 % VS
10 % (Cohen et coll, 1992).
L'éclosion assistée au laser a été
proposée à des couples ayant eu en moyenne 3,3 échecs
d'implantation et 10 embryons transférés in utero.
Le taux de grossesses évolutives par transfert est meilleur
après éclosion assistée et varie de 12,5
% à 41,9 % en fonction du nombre d'embryons transférés
(1 à 5) vs 6.3 % à 13,7 % chez les témoins,
respectivement. Quarante quatre enfants sont nés après
éclosion assistée dans cette équipe, tous
normaux (Obruca et coll, 1994).Les résultats français
de l'éclosion assistée sont moins spectaculaires.
Olivennes et coll (1994) obtiennent un taux de grossesse par transfert
de 24,3 % chez les patientes ayant eu4 transferts de 3 embryons
sans grossesse évolutive, et 22,2 % pour les patientes
de plus de 38 ans (âge moyen : 41 ans). Ces résultats
semblent se confirmer au long cours, principalement pour les patientes
âgées. Les auteurs insistent sur le rôle joué
par l'entraînement du personnel sur l'efficacité
de la méthode.
Nous avons proposé une éclosion embryonnaire assistée
aux patientes ayant eu (comme pour les cocultures) plusieurs échecs
d'implantation et/ou ayant plus de 38 ans. Cette technique était
souvent proposée après échec de la coculture.
Il s'agissait donc de patientes ayant un très mauvais pronostic.
L'éclosion assistée était réalisée
à l'hôpital Necker sur des embryons provenant de
patientes de l'hôpital Tenon, l'hôpital de Sèvres
et la clinique de La Muette. Soixante quatorze patientes ont bénéficié
de cette technique. En moyenne2,6 embryons ont été
transférés et 8 patientes ont obtenu une grossesse.
Le taux de grossesse global par transfert est faible (11 %) et
varie suivant les centres, le nombre d'embryons transférés
et l'indication : de 0 à 17 % (Mandelbaum, communication
personnelle). Ainsi, chez ces patientes ayant souvent de multiples
échecs d'implantation, un âge avancé, des
anomalies du développement embryonnaire et un (ou plusieurs
échecs de coculture) le bénéfice de cette
technique est modeste (voire nul).Il est également possible
de combiner coculture et éclosion assistée. Ainsi
Tucker et coll (1994) ont inclus dans un protocole randomisé
100 patientes ayant, soit au moins 38 ans, soit de multiples échecs
antérieurs d'implantation ; le taux de débuts de
grossesse (b hCG positifs) et le taux d'implantation par embryon
étaient plus élevés après coculture
(42 heures sur cellules d'oviducte de bovins) + éclosion
assistée (à J3 avant le transfert in utero) qu'après
éclosion assistée seule (52 % vs 32 %) et (18 %
vs 10 %), respectivement. Il y aurait donc un effet cumulatif
de ces 2 techniques. La coculture favoriserait l'activation du
génome embryonnaire et le métabolisme de l'embryon
alors que l'éclosion assistée permettrait de dépasser
les anomalies de la zone pellucide. Il est dommage que les auteurs
n'aient pas comparé ces résultats à ceux
de la coculture seule laquelle agit également sur l'amincissement
de la zone pellucide et donc sur l'éclosion.
LES RISQUES DES NOUVELLES TECHNOLOGIES
Il est clair que toute innovation technique doit satisfaire à
2 critères : efficacité et innocuité. Si
l'efficacité est encore en cours d'évaluation, l'innocuité
doit être démontrée très rapidement.
Or les cocultures ne sont pas dénuées de risques
et en tout premier lieu de risque infectieux, et cela à
2 niveaux : à l'origine (contrôles réalisés
chez le fournisseur) et au cours de la culture (au laboratoire).
Le risque d'incorporation de germes pathogènes augmente
avec la durée de la culture et le nombre de réensemencements
successifs, en particulier pour les mycoplasmes et les virus.
Il est donc impératif de faire contrôler les sous-cultures
dans un laboratoire spécialisé ou bien de réaliser
des cultures courtes (5 à 6 jours maximum) à partir
de cellules souches congelées et dûment contrôlées.
L'utilisation de cellules autologues (granulosa, endomètre)
ou de cellules Vero de l'OMS (à usage clinique) diminue
le risque d'infection primitive mais laisse entier le risque d'infection
de la culture au laboratoire. Il est donc considéré
par les virologues comme dangereux de cumuler éclosion
assistée puis coculture car la protection assurée
par la zone pellucide devient dans ce cas caduque.
L'éclosion assistée induit des risques spécifiques
:
- perte de la protection de l'embryon par la zone pellucide 2
à 3 jours plus tôt que le moment habituel, pouvant
provoquer in vivo une infection et l'invasion par les leucocytes
;
- anomalies de l'éclosion dues à une brèche
trop petite, pouvant aller de la formation de jumeaux monozygotes
à l'absence complète d'éclosion. Actuellement
on ne note pas d'augmentation du taux de jumeaux monozygotes chez
ces couples.
CONCLUSION
Les cocultures permettent aujourd'hui (moyennant un important
surcroît de travail au laboratoire) d'obtenir des grossesses
après FIV à un taux au moins égal à
celui obtenu par les techniques standard. Elles permettent également
de proposer à des couples ayant de faibles chances de procréer
après de nombreux échecs d'implantation, une technique
nouvelle motivante mais dont la supériorité (par
rapport aux techniques classiques) n'est pas encore totalement
démontrée. Elles ont une finalité diagnostique
: les couples pour qui le développement embryonnaire s'arrête
répétitivement avant le stade blastocyste ont de
très faibles chances de grossesse. Elles permettent de
sélectionner parmi les embryons surnuméraires ceux
qui atteignent le stade de blastocyste et donc ont de meilleures
chances d'implantation, diminuant ainsi le nombre d'embryons congelés
et stockés. Elles permettent de transférer 1 seul
embryon (sélectionné) chez les couples pour qui
une grossesse multiple est non désirée ou médicalement
déconseillée.
Il n'existe aujourd'hui aucune preuve que l'éclosion assistée
améliore réellement les chances d'implantation.
Pourtant il est vraisemblable que chez certaines patientes, l'échec
d'implantation soit lié à un échec d'éclosion
(zone pellucide épaisse ou résistante). Il est actuellement
impossible d'identifier ces patientes. Des études randomisées
et ciblées seront nécessaires avant d'affirmer la
réelle efficacité de cette technique.
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M. PLACHOT** Laboratoire de Fécondation in Vitro et Biologie
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: JOURNÉES
DE TECHNIQUES AVANCÉES EN GYNÉCOLOGIE OBSTÉTRIQUE
ET PÉRINATALOGIE PMA, Fort de France 11 - 18 janvier 1996
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