Qu'entend-on par "dosage" des anticorps ?

Labs, 57 Route de Canta-Gallet, 06200, Nice.

La détermination des anticorps est depuis longtemps un examen important en médecine humaine et vétérinaire. Le tableau I donne une liste de ses principales applications.

Dans bien des situations, la présence d'anticorps n'acquiert de signification qu'associée à une notion quantitative : par exemple le diagnostic de nombreuses maladies infectieuses n'est assuré que sur le vu de deux sérologies successives à titre croissant exécutées à deux semaines d'intervalle. On se contente parfois d'un seul taux significatif, par exemple un titre IgM suffisamment élevé dans les infections récentes. Autres exemples de l'utilité d'une notion quantitative : le taux d'anticorps significatif d'une immunité après vaccination (par exemple pour l'hépatite B) ou encore du risque foetal lors d'une immunisation Rh.

Ce rappel n'a d'autre but que de souligner que l'évaluation quantitative des anticorps a depuis longtemps prouvé son utilité en médecine. On est cependant étonné de la faiblesse des bases scientifiques de cette détermination.

Y a t-il des bases rationnelles à la mesure quantitative des anticorps ?

Les difficultés fondamentales qui s'opposant à la mesure des anticorps au sens métrologique du terme ne peuvent être passées sous silence. La variabilité des méthodes, la faible reproductibilité inter-méthodes, le manque d'homogénité de l'expression des résultats, la difficulté à mettre au point les schémas de contrôle de qualité ne sont pas uniquement liées à des problèmes technologiques, mais plus fondamentalement au manque de bases scientifiques solides de cette mesure. Les méthodes apparues récemment dans les laboratoires et en particulier l'ELISA procurent un résultat numérique qui a toutes les apparences de la mesure quantitative, mais ne donnent qu'une illusoire sécurité, et on ne peut éluder la nécessité d'une réflexion approfondie sur le sujet (1, 2).

Tableau I

Applications de la détermination des anticorps

En médecine

Xéno-immunisation

Diagnostic, vérification de l'immunité dans les maladies infectieuses, à virus, bactéries, champignons, protozooaires, helminthes, etcé

Poumon de fermier et syndrômes apparentés, sensibilisation à certains médicaments (p. ex. insulinorésistance due à des anticorps anti-insuline animale, thrombopénies induites par des médicaments, etcé)

Allergie : détermination des anticorps d'isotype IgE et IgG (surtout IgG4)

Contrôle d'efficacité des vaccinations et des désensibilisations des allergiques

Surveillance de la production d'anticorps thérapeutiques (ex tétanos) chez les volontaires

Allo-immunisation

Surveillance de la production d'anticorps thérapeutiques (ex anti-D) chez les volontaires

Surveillance de l'allo-immunisation au cours de la grossesse ou des greffes (anticorps anti-HLA,anti-organe, anti-groupe sanguins, anti-leucocytes, anti-plaquettes é)

Auto-immunisation

Anticorps anti-organites (ex mitochondries), contre des ag spécifiques de tissu (ex thyroglobuline)

Anti-idiotypes

Phénotypage

Groupage ABO

Dans d'autres disciplines

Epidémiologie

Recherche biologique et pharmaceutique (recherche et développement et production : anticorps polyclonaux ou monoclonaux utilisables pour le diagnostic (maladies humaines et animales, phytopathologie) et usage thérapeutique.

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Par définition, et contrairement aux antigènes, un anticorps ne peut se déterminer que par des procédés immunochimiques. Cette détermination est basée sur les effets identifiables, voire mesurables de la réaction des anticorps vis à vis des molécules antigéniques sélectionnées pour le test. Cette interaction n'est pas le fait de la globalité des molécules mais plus précisément des zones spécifiques aujourd'hui dénommées épitope et paratope. Mais la plupart des antigènes communs sont macromoléculaires et multi-épitopiques, et d'autre part la réponse anticorps révèle une extraordinaire complexité, qui n'a aucun équivalent en biologie. La réaction antigène-anticorps globale est la somme de centaines et probablement de milliers de réactions individuelles impliquant souvent des antigènes différents et divers sites portés par les divers antigènes et des anticorps multiples correspondant à ces divers sites. Dans ces conditions la standardisation des systèmes analytiques ne peut être que difficile.

Les antigènes

On sait aujourd'hui, que la surface d'une macromolécule peut être considérée comme un continuum de sites antigéniques (3), certains étant toutefois plus efficaces que d'autres. C'est ce qui a permis de définir la "carte épitopique" de nombreux antigènes. Il est certain que chaque épitope a une véritable personnalité, certains ayant une signification diagnostique forte, d'autres ayant une importance physiopathologique, d'autres étant protecteurs, d'autres enfin étant "neutres", voire même à l'origine de réactions croisées entraînant un défaut de spécificité des tests.

Les anticorps

La réponse à un antigène unique, voire à un simple épitope peut être d'une extrême complexité. De nombreux variants peuvent être synthétisés différant à la fois par leur partie variable et leur partie constante. Les divers isotypes correspondent à des diverses parties constantes : ils ont, comme on le sait, des tailles, des compositions et des propriétés fonctionnelles différentes. La commutation IgM —> IgG est un exemple bien connu des biologistes par ses implications disgnostiques. Le rôle physiopathologique des IgE (et des IgG4) est un autre exemple. Sur le plan analytique, l'existence de ces divers isotypes de poids moléculaire différent exclut l'usage d'unités pondérales communes pour les anticorps. Des unités molaires seraient logiques, mais posent d'autres questions. Avec les parties variables des anticorps, on touche à la spécificité de la réaction antigène-anticorps, et au phénomène connu sous le nom de dégenérescence. On entend par là le fait qu'un même épitope entraîne le plus souvent la synthèse de plusieurs anticorps de paratopes différents (géométries, tailles, nombres de points d'interaction avec l'épitope, constantes d'affinité intrinsèque différentes). Il y a peu d'études sur la signification physiopathologique d'anticorps d'affinités différentes, bien que le bon sens suggère que des anticorps d'affinité élevée sont plus efficaces (p.ex en termes de protection) que des anticorps de faible affinité. Il n'en est pas de même au plan diagnostique et des anticorps de faible affinité (par exemple anticorps de classe IgM, comme un anticorps IgM anti-HBc, ou facteur rhumatoïde) peuvent avoir une forte signification diagnostique.

Pour compléter ce tableau complexe, il faut ajouter le fait que tout anticorps peut donner naissance à de nouveaux anticorps dirigés contre l'élément de nouveauté apparu dans l'organisme, c'est à dire précisément le site anticorps (et la zone adjacente) : ces anticorps sont connus sous le nom d'anticorps idiotypiques et peuvent eux mêmes donner naissance à des anticorps anti-idiotypiques, censés ressembler à l'antigène initial. Cet ensemble constitue ainsi, selon les théories modernes, un réseau régulateur de l'immunité.

Des facteurs multiples règlent la variabilité de la réponse anticorps. On peut citer la constitution génétique, le mode et l'intensité de l'immunisation, la durée par rapport à l'immunisation. Il n'est cependant pas possible de prédire la subtile combinaison qui résulte d'une immunisation, même relativement peu complexe.

A titre d'exemple, plaçons nous ici dans une situation idéale simplifiée où l'on a affaire à une molécule antigénique spécifique, ne contenant aucun épitope donnant lieu à réaction croisée avec d'autres antigènes. Imaginons qu'un antigène protéique comporte dix sites épitopiques et que chacun d'eux donne naissance à des anticorps spécifiques dont les constantes d'affinité intrinsèque varient de 10-5 à 10-10 L/mol, et qu'enfin les neuf isotypes différents soient représentés dans l'échantillon à analyser : on voit qu'il est illusoire de vouloir quantifier valablement cet ensemble par une seule valeur. L'extrême complexité de l'entité "anticorps" même si on la limite à une spécificité ou un groupe de spécificité n'a pas d'équivalent en biologie. Parce qu'en définitive on identifie une fonction, portée par diverses molécules et non une structure, le Ç dosage È des anticorps n'a donc pas de sens métrologique, et même si l'on peut parvenir à un compromis, il est exclu de parvenir à un standard de mesure équivalent à ceux d'autres domaines de la biochimie.

Faut-il néanmoins chercher à mesurer les anticorps ?

En d'autres termes, faut-il rechercher des compromis permettant cependant de guider le praticien dans sa démarche diagnostique ou de suivi du patient et aboutir à des définitions pragmatiques, et renoncer de ce fait à parvenir à un niveau élevé de standardisation ? De toute évidence, la réponse est oui, puisqu'aussi bien il s'agit de la pratique actuelle courante.

Sur quelles bases un pareil compromis peut il être fondé ? Une condition de validité de toute méthode quantitative est que les courbes dose-effet réalisées à partir de diverses dilutions des échantillons variés suivent la même loi, que l'on peut alors modéliser. L'expérience montre que l'on n'arrive pas à ce niveau d'homogénité, comme on pouvait s'y attendre d'après ce qui précède. Toutefois, on peut observer fréquemment un fait interessant : prenons un système antigène-anticorps complexe comme par exemple extrait de toxoplasme et anticorps correspondants et construisons les courbes dose-effet d'une méthode ELISA à partir d'échantillons de serum de nombreux patients (4). En général, les courbes, bien qu'elles ne soient pas vraiment parallèles, ne se croisent pas dans la zone de mesure. Ceci donne la base d'un compromis méthodologique. A partir de cette constatation, il est en effet possible de donner un numéro d'ordre à ces différentes courbes en fonction de leur place par rapport aux voisines et l'on peut donc les classer en fonction de leur ÇtauxÈ d'anticorps et ce, quelle que soit la dilution mesurée. Certains ont même cherché à donner une modélisation mathématique de ce qui était observé dans un système de coordonnées semi-logarithmiques : c'est par exemple, la base de la méthode dite "Alpha" pronée par la firme Behring qui est conçue pour permettre, à partir d'une dilution standardisée et par comparaison avec un échantillon étalonné en Unités Internationales, de donner une réponse quantitative (5). La relation préconisée est log 10 titre = a (signal) b, a et b étant caractéristiques du réactif et même du lot.

Toutes ces tentatives, quelqu'elles soient, (quelques unes sont indiquées dans le tableau 3) postulent que toutes les courbes dose-effet suivent une même loi modélisable, ce qui, en particulier, signifie qu'aucune courbe ne se croise, ce qui n'est malheureusement pas exact. Nous avons fait allusion à un compromis et non pas à une loi. Il existe en effet des exceptions à cette observation de "non croisement" des courbes. Ceci signifie que la place qu'on leur attribue dans un système ordinal n'est pas la même selon la dilution mesurée, et qu'il est donc impossible de leur attribuer un classement, mais seulement une fourchette. La seule façon d'identifier ces échantillons inclassables est de construire la courbe entière, ce qui ne donne pas pour autant la réponse à la question du taux qu'il faut leur attribuer. Autrement dit, les méthodes de ÇmesureÈ des anticorps garderont toujours un caractère aléatoire, et il existera toujours des échantillons inclassables, qu'on ne peut toutefois repérer que par une étude approfondie de l'échantillon (6).

Quel calibrateur choisir pour les déterminations d'anticorps ?

Compte tenu des incertitudes associées au principe même de la mesure quantitative des anticorps, il est évident que la calibration de ces mesures pose également un problème scientifiquement insoluble. La règle d'or qui préside au choix d'une préparation de référence destinée à la standardisation est qu'elle doit être aussi semblable que possible aux échantillons à déterminer. Il est évident, compte tenu de ce qui a été dit plus haut, qu'avec les anticorps, on se heurte à'une impossibilité. Aussi doit-on limiter son ambition à la sélection d'une préparation qui ne présente pas de différences apparentes avec la majorité des échantillons à traiter.

En particulier, il faut éliminer certaines causes d'absence d'homogénéité entre le calibrateur et les échantillons les plus fréquemment rencontrés.

- dans le cas le plus général, tel que celui de nombreuses maladies infectieuses, la réponse anticorps est dirigée contre des épitopes multiples appartenant à de nombreux antigènes. Il faut s'assurer que le calibrateur répond à un mode de réponse qualitatif le plus fréquent possible. Par exemple, la pratique du Western-blot chez les patients séro-positifs à l'égard du VIH montre parfois des distributions de la réponse anticorps singulières et il serait absurde de choisir un calibrateur dans cette catégorie. Il est certain que ce problème se pose d'autant plus que la stimulation est complexe : le Plasmodium conduit à une réponse immune plus complexe qu'une bactérie revetue d'un antigène polyosidique de surface. Il est évident que la nature du système antigénique utilisé dans la méthode en cours est essentiel (voir plus loin).

- l'affinité des anticorps du calibrateur doit être aussi identique que possible à celle des échantillons, car cela est une cause évidente de non-parallélisme des courbes de dilution. Une même quantité absolue d'anticorps conduira à une sous-estimation systématique de l'échantillon si les anticorps du calibrateur ont une affinité beaucoup plus grande que ceux de l'échantillon, et ceci variera encore en fonction de la méthode utilisée.

- enfin, comme pour tout standard, il faut prendre garde au milieu dans lequel les anticorps se trouvent et qui peuvent génerer des erreurs liées à ce qu'il est convenu de dénommer l'effet matrice, Ces milieux doivent être aussi identiques que possible.

En pratique, dans le domaines des anticorps, il existe une soixantaine de préparations de préparations internationales de référence ou de standards internationaux (la différence entre les deux tient au fait que seuls les standards internationaux font l'objet d'une étude coopérative complète). A l'exception de cinq, elles ont été établies avant 1980 et n'ont pas été étudiées sous un angle quantitatif avec les méthodes récentes. Leur choix s'est fait de façon assez empirique et de grandes différences existent entre les concepts et les méthodes qui ont présidé à leur sélection. Ces préparations sont souvent utilisées pour servir de base à la mesure de quantité d'anticorps, mais il est évident que les valeurs qu'elles permettent d'établir ne sont qu'indicatives. Ceci est d'autant plus vrai que les standards internationaux ne constituent pas des réactifs de travail, mais des préparations destinées à la préparations d'étalons secondaires, nationaux ou commerciaux. On voit donc qu'il existe ici une nouvelle cause potentielle de biais.

Sélection de la préparation antigénique

Toute méthode de détermination des anticorps utilise une préparation antigénique dont la nature règle la spécificité de la réaction. Si les standards ont été sélectionnées avec une préparation antigénique différente de celle utilisée par la suite, le risque de dérive est évident. Le tableau 2 rappelle les principales formes sous lequel le (ou les) antigènes peu(ven)t se trouver. Au cours des maladies infectieuses, de l'allergie ou de l'auto-immunité, les antignèes potentiellement immunisant sont nombreux et complexes, mais ne jouent pas un rôle équivalent et certains d'entre eux jouent un rôle décisif. La sélection des antigènes utiles à titre diagnostique ou pour la surveillance d'un niveau d'immunité fait actuellement de grand progrès. Par exemple on sait

maintenant que l'antigène actif dans les préparations cellulaires utilisées pour l'identification des anticorps anti-microsomes est la thyroperoxydase. (7). On peut aujourd'hui réaliser une dissection encore plus fine au niveau épitopique (8), mais ces travaux sont encore loin d'être achevés et bien qu'elle soit encore en partie empirique, l'étape de sélection de la préparation antigénique utilisée dans le test pour la capture de l'anticorps est essentielle.

Techniques utilisées pour la détermination des anticorps

Il n'est pas surprenant qu'aucune méthode de référence n'ait été proposée. Le biologiste doit choisir une technique sur la base de ses caractéristiques favorables (sensibilité, spécificité, reproductibilité,

Tableau 2

Caractères des préparations antigéniques utilisées

pour les déterminations d'anticorps

1. Natifs

Dans leur contexte cellulaire [p. ex. cellules ou coupes de tissu utilisées pour l'immunofluorescence, globules rouges, lymphocytes, bactéries ou parasites employés en agglutination, cellules mobiles (treponèmes, spermatozoïdes) ou immobilisées]

2. Extraits bruts

Extraits non ou peu purifiés : p. ex. extraits de déjections d'oiseaux pour le "poumon de fermier", ou extrait brut de pollen pour le RAST.

3. Extraits purifiés

p. ex thyroglobuline : toutefois une protéine purifiée représente un mélange complexe de sites épitopiques.

Parfois instables : ex. ADN double brin

4. Oligo ou mono épitopiques

Haptènes (en général avec un bras porteur)

Peptides de synthèse

5. Analogues

Anticorps anti-idiotypiques

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transférabilité, rapidité, commodité, coét etcé), et ne doit jamais oublier l'existence possible de biais. Les principales méthodes actuelles sont l'agglutination (hémagglutination et agglutination de particules), l'immuno-précipitation, la fixation du complément, l'immobilisation et les tests de neutralisation. Mais les méthodes avec réactifs marqués (isotope, fluorochromes, enzymes, composés luminescents) ont fait une percée remarquable et sont de plus en plus utilisées à cause de leur meilleure reproductibilité et sans doute, en raison de l'illusion quantitative qu'elles procurent. L'ELISA paraît, par sa rusticité particulièrement bien adaptée à ce cas.

La précipitation en milieu liquide ou en gel n'est maintenant utilisée que dans des situations spécifiques. Elle ne peut déceler les anticorps que s'ils sont en forte concentration et avec une forte affinité, c'est à dire dans des conditions d'hyper-immunisation où les anticorps de classe IgG prédominent (par exemple dans la maladie des éleveurs d'oiseaux). Les tests d'agglutination sont encore aujourd'hui très employés dans des configurations variées (hémagglutination, agglutination de particules en particulier tests au latex). Ce sont des méthodes assez sensibles, qui tendent à privilégier les anticorps de classe IgM. On peut les réaliser dans des formats très simples, et de ce fait elles sont peu coûteuses. Elles sont mal adaptées à la détermination à prétention quantitative, car le procédé le plus utilisé est la titration avec des gammes de dilution de raison 2, dont la précision n'est, au mieux, que de 100%. Le titre est par convention la dernière dilution positive, mais cette dilution ultime est précisément celle où l'erreur analytique est la plus élevée et pour cette raison, la mesure du titre est un index qauntitatif particulièrement peu fiable. L'utilisation de néphélomètre a introduit une possibilité nouvelle de rendre l'agglutination quantitative. L'agglutination est malheureusement très sensible aux conditions du milieu. Les interférences sont fréquentes et la reproductibilité souvent insuffisante.

Les méthodes utilisant les réactifs marqués sont aujourd'hui très en vogue et parmi elles, les réactions en phase solide tendent à remplacer toutes les autres méthodes. Leur succès est lié à leur commodité d'emploi, à l'élimination de subjectivité de l'opérateur (au moins pour les méthodes ELISA), à une réponse numérique continue, à leur reproductibilité satisfaisante, à leur robustesse, à l'existence de trousses commerciales prêtes à l'emploi et enfin à l'existence de procédés permettant simultanément l'identification des isotypes en cause. L'ELISA est sans doute la méthode la mieux adaptée à la détermination des anticorps. Quatre schémas réactionnels de base peuvent être employés avec des variations possibles (Fig 1)

Nous avons insisté sur les problèmes métrologiques fondamentaux que crée l'hétérogénéité des anticorps. A ceux ci s'ajoutent des problèmes d'ordre technologique. Dans le cas des dosages en phases solide de type ELISA, trois facteurs influencent le résultat de la détermination. L'un constitue l'objet même de la détermination : c'est la concentration en sites anticorps, un second est leur affinité, un troisième est la densité des sites antigéniques sur la phase solide. Plusieurs articles ont débattu de l'importance relative de la concentration (9) ou de l'affinité (10) des anticorps sur le résultat. Les expériences de Peterfy et coll. (11) et les calculs de Griswold (12) montrent que l'ELISA peut se comporter comme influencé ou non par l'affinité des anticorps. Selon Griswold, la densité antigénique sur la phase solide est le paramètre déterminant. En effet, à faible densité antigénique, le nombre d'anticorps susceptibles de se lier simultanément à deux épitopes est faible et l'affinité intrinsèque des anticorps devient un facteur très important déterminant le nombre de molécules liées. En revanche, si la densité épitopique est suffisamment élevée, il peut y avoir de nombreuses liaisons "bigamiques" (ou plus, si l'IgM est en cause). L'affinité intrinsèque cède alors le pas à l'affinité fonctionnelle ou avidité, qui peut être 100 fois plus élevée que la première. L'affinité intrinsèque passe alors au second plan.

Bien d'autres facteurs peuvent influencer la réaction, mais ceci est vrai de toutes les méthodes immunochimiques. Citons la température, la force ionique du milieu, sa constante diélectrique, la durée de la réaction, etc. On n'oubliera pas les interférences liées aux complexes immuns et autres diverses formes d'anticorps anti-globulines, spontanés ou induits; les réactions croisées liées à la sélectivité insuffisante de la préparation antigénique. Enfin, un problème majeur commun à toutes les méthodes en phase solide mais surtout à la méthode "à double anticorps" (fig 1a) s'observe chaque fois que l'anticorps est peu abondant dans l'échantillon. Dès lors, pour le mettre en évidence, on ne peut diluer beaucoup l'échantillon. L'anticorps se trouve mélangé à d'autres immunoglobulines, non spécifique de l'antigène en cause, se trouvant à un taux mille, dix mille voire cent mille fois plus élevé que l'anticorps spécifique. Une absorption physique non-antigène spécifique,

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Tableau 3

Mode d'expression des résultats

Echelle nominale :

Réponse par oui ou par non

Le choix d'un niveau discriminant ("cut-off") est indispensable

• souvent déterminé en l'absence d'étude épidémiologique complète : p.ex. trois fois la valeur du blanc.

• déterminé après étude épidémiologique : quel but poursuit-on ?

Echelle ordinale :

• Unités arbitraires : souvent scores allant de 0 et + à ++++

• Classes (exemple IgE spécifiques)

• Titration à point final (titre)

• Echelle résultant d'un étude de population : p. ex. percentiles

Echelle proportionnelle :

• Titration à 50% de réponse

• Réponse analytique brute (p. ex. absorbances après ELISA)

• Réponse rapportée à un échantillon négatif (p. ex. multiples de l'absorbance d'un échantillon négatif)

• Réponse rapportée à un échantillon positif (habituellement interpolation à partir d'une courbe de calibrage)

• Traitement mathémathique de la réponse (par exemple MONA : multiple de l'activité normale)

Les résultats peuvent être exprimés sous forme de données de laboratoire non transformées, d'unités arbitraires, d'unités commerciales, d'unité de consensus (c'est à dire d'unités locales, nationales, multinationales, ou d'Unités Internationales) ou enfin d'unités pondérales ou même fractions molaires.

même relativement faible, conduit à un bruit de fond élevé et à un rapport signal/bruit de fond désastreux. Ceci est d'autant plus net qu'il y a davantage d'IgM dans l'échantillon (13)

Mode d'expression des résultats

L'incertitude des expérimentateurs est bien reflétée par la diversité des façons d'exprimer le résultat d'une détermination d'anticorps comme l'indique le tableau 3. Le même échantillon peut donner lieu à des résultats fort différents en fonction non seulement de la méthode, mais du traitement des données (14, 15).

La mesure de l'avidité des anticorps

Puisque le résultat d'une détermination est fortement influencé par l'avidité des anticorps, à défaut de mesurer la quantité d'anticorps, est-il possible et vaut-il la peine de mesurer leur affinité à l'égard de l'antigène ? Le bon sens suggère que des anticorps se liant fortement à l'antigène sont plus efficaces que ceux qui s'en dissocient facilement. On sait que de tels anticorps sont les plus efficaces pour la neutralisation de virus, l'élimination immune et la fixation du complément. Mais à ce jour, les études fondamentales sur ce sujet n'ont pas été exploitées en médecine de façon courante. Par ailleurs, la physiologie immunologique nous apprend qu'au cours de l'immunisation, un lent processus de maturation s'opère, caractérisé par une sélection des anticorps de meilleure affinité intrinsèque (sachant que le phénomène n'est pas simple et qu'il peut y avoir également synthèse simultanée ou séquentielle d'anticorps de faible affinité). Néanmoins, à partir de cette constatation, on peut en principe définir le caractère récent ou actuel d'une infection, non plus sur la base de l'isotype des anticorps en cause (IgM voire IgA) mais à partir de la mesure de leur affinité fonctionnelle.

Rappelons ici quelques définitions : l'affinité d'un anticorps est une notion physico-chimique rattachée à la constante d'association entre l'antigène et l'anticorps. En réalité, il est impossible d'appliquer ces principes thermodynamiques à la situation commune complexe d'un système antigène-anticorps (antigène multivalent, anticorps polyclonaux divalents ou plus, dirigés contre les divers épitopes, chacune d'eux ayant une constitution et une affinité particulière). Pour pouvoir le faire, il faut se placer dans des situations artificiellement simplifiée : par exemple,fragment Fab (donc monovalent) d'un anticorps monoclonal dirigé contre un haptène monovalent. Dans cette situation, on peut mesurer expérimentalement (par exemple par la méthode d'équilibre de dialyse) ce que l'on appelle la constante d'association intrinsèque en utilisant par exemple la représentation de Scatchard de la loi d'action de masse (16). Cette constante est la mesure de l'affinité intrinsèque. Lorsqu'on considère les systèmes antigène-anticorps courants, ce concept devient insuffisant pour plusieurs raisons : (a) l'hétérogénité des anticorps fait qu'on ne peut plus mesurer que des moyennes. Mais une moyenne n'a de sens que si l'on a en même temps une idée de la distribution des valeurs et pour cela on est obligé de faire des hypothèses approximatives (par exemple distribution de Sips); (b) le fait que les anticorps soient di ou multivalents peut changer considérablement la solidité de la liaison entre l'antigène et l'anticorps. Ceci ne se voit que si l'antigène, par le caractère répétitif de sa structure ou par la formation de complexes cycliques permet la formation de liaisons multiples qui stabilisent l'ensemble : on passe alors de la notion d'affinité intrinsèque à celle d'affinité fonctionnelle, encore dite avidité. On peut observer des anticorps avec une faible affinité intrinsèque, comme les IgM, présenter cependant une forte affinité du fait des liaisons multiples. L'avidité est une notion pratique sans bases métrologiques précises du fait de la complexité des systèmes et de l'impossibilité de trouver des bases scientifiques pour sa mesure. Néanmoins, on comprend intuitivement que cette notion vise à l'évaluation de la force globale de la liaison d'un système complexe d'une famille antigénique vis à vis des anticorps qui lui correspondent; (c) enfin, les techniques de mesure de l'affinité sont complexes (par exemple résonance magnétique nucléaire, augmentation de fluorescence, etcé) sans pour autant être directement applicables aux situations réelles de la biologie médicale.

Dans ce contexte, est apparue une méthode simple (17) basée sur la plus ou moins grande facilité avec laquelle il est possible de prévenir la formation de complexes antigène-anticorps par des substances connues pour inhiber la formation de liaisons hydrogène (par ex. le chlorhydrate de guadinine). L'idée est que les liaisons de forte affinité sont moins facilement inhibables que celles de faible affinité. Il suffit donc de comparer les taux limites d'anticorps obtenus en présence et en l'absence de l'agent dissociant pour avoir une idée de l'impotance des anticorps de haute affinité dans l'échantillon.

Plusieurs variantes de la méthode initiale ont été depuis décrites et appliquées à des pathologies telles que la rubéole (18, 19), le groupe varicelle-zona (20), la néphropathie épidémique à hantavirus (21), la toxoplasmose (22,23). Les méthodes les plus récentes cherchent à dissocier les complexes antigènes-anticorps formés au cours de la réaction plutôt que de prévenir leur formation. D'autres composés dissociants,tels que la diéthanolamine ou l'urée en solution à 6 ou 8 mol/L ont été utilisées.

Les résultats de cette nouvelle méthode sont fort encourageants pour la datation d'une infection. Le différentiel de titre des réactions avec et sans agent dissociant sur un même échantillon est très inférieur dans les infections anciennes à ce qu'il est dans les infections récentes. Bien entendu, les valeurs significatives dépendent étroitement des conditions techniques et du mode d'expression des résultats. Par exemple, pour un ELISA IgG/toxoplasme, le rapport moyen des titres est de 8,5 % pour les serums d'infection récente et de 50% pour les infections anciennes (23). D'après les premiers travaux, il semble exister une assez nette différence entre les deux types de serum et ce, quelle que soit la nature de l'infection.

Nous retrouvons donc avec ces méthodes la même problématique que pour la détermination quantitative des anticorps : nous disposons de méthodes qui n'ont pas vraiment de bases métrologiques solides et qui sont donc difficiles voire impossibles à standardiser. Néanmoins, elles ont une relation évidente avec ce que l'on cherche à mesurer : une quantité dans le premier cas, une affinité fonctionnelle dans le second, mais les causes de biais sont nombreuses.

Conclusion

Il faut donc tirer de tout cela quelques conséquences pratiques :

- la détermination quantitative des anticorps (au sens métrologique du terme) est impossible et il en est de même de la standardisation des méthodes. Cependant l'utilisation de préparations de référence n'est pas inutile, car elle contribue à rapprocher des titres qui pourraient autrement être bien plus dispersés. Il peut exister des échantillons qui donnent des résultats discordants selon les méthodes et/ou les dilutions. La détermination de l'affinité fonctionnelle est sujette aux mêmes critiques fondamentales.

- l'obtention de données quantitatives par des méthodes telles que l'ELISA ne doit donc pas faire illusion : il ne s'agit pas d'une véritable mesure, car les facteurs en cause dans la réaction sont très complexes. Une variation du résultat peut aussi bien signifier une variation de la quantité d'anticorps qu'une variation de leur affinité fonctionnelle .

- il ne faut donc pas attacher une croyance absolue en l'identité de deux résultats chiffrés égaux, même s'ils sont exprimés en U.I., dès lors qu'ils sont obtenus avec des méthodes ou des lots différents.

- toutefois l'utilisation de préparations de référence étalonnées en d'unités communes (en particulier U.I) constitue un pas vers une amélioration de la dispersion des résultats.

- la comparaison des méthodes doit donc se faire sur des bases très pragmatiques : reproductibilité, robustesse, mais avant tout en fonction de leur corrélation avec les faits cliniques.

- un patient doit donc être suivi par une même méthode et si possible par un même laboratoire. Il est donc important d'indiquer la nature de la trousse diagnostique utilisée. Il ne faut jamais modifier les conditions opératoires indiquées par le fabricant.

- chaque fois que possible, il faut inclure dans les séries des échantillons de serums provenant de situations cliniques connues dont on possède un grand nombre d'aliquots. Ceci peut aider l'interprétation de cas difficiles.

- le choix des valeurs discriminantes est délicat. Il faut d'abord déterminer le but souhaité. La détermination des valeurs Çcut-offÈ ne peut résulter que d'études clinico-biologiques approfondies, tenant compte des notions de spécificité et de sensibilité diagnostique.

Bibliographie