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Titre: Le diagnostic génétique pré-implantatoire (DPI) Techniques de biopsie embryonnaire en vue d’un DPI
Année: 2001
Auteurs: - Hamamah S.
Spécialité: Gynécologie
Theme: diagnostic pré-implantatoire

Le diagnostic génétique pré-implantatoire (DPI)

Techniques de biopsie embryonnaire en vue d’un DPI

S. Hamamah1, F. Entezami1, F . A. Arnal1

1 Centre de fécondation in vitro, hôpital A. Béclère, Clamart,
2 Centre de fécondation in vitro, hôpital Villeneuve, 34 000 Montpellier

Depuis les premières tentatives de biopsie embryonnaire et d’obtention de grossesse (Handyside et al 1990) le diagnostic de l’aneuploïdie et du sexe par hybridation était in situ fluorescente (FISH) a connu une évolution remarquable. La première application du DPI était de permettre de dépister dans le cadre des maladies liées à l’X, les sujets susceptibles d’être atteints. En effet, des sondes et des amorces spécifiques ont été utilisées pour sélectionner les embryons après biopsie de blastomère (Handyside et al 1989, Penketh et al, 1989). Plus de 1200 cycles de DPI ont été réalisés (701 cycles ont été effectués pour des anomalies chromosomiques et 458 pour des maladies génétiques) pour 770 patientes conduisant à 231 grossesses (20% après DPI) et 166 naissances (Verlinsky et al, 1997).
La biopsie en vue d’un DPI peut être réalisée : (1) au niveau de l’ovocyte sur le globule polaire; (2) au niveau de l’embryon au stade 6-8 cellules (J3) par un prélèvement de 1 ou 2 blastomères; et (3) au niveau de l’embryon au stade de blastocyste (J5-J6) par prélèvement de cellules trophoblastiques.

I. Biopsie de globule polaire de l’ovocyte

Cette approche a l’avantage de refléter exactement l’équipement chromosomique de l’ovocyte. La biopsie du 1er globule polaire se réalise 3 heures après la ponction ovocytaire. Afin que cette approche soit fiable, l’analyse doit s’effectuer sur les deux golbules polaires, permettant ainsi de détecter de possible anomalies de non disjonctions méiotiques pendant la première et la deuxième division de méiose chez la femme porteuse d’aberration chromosomique.
Comme la plupart des aneuploïdies sont d’origine maternelle et rarement d’origine paternelle, cette méthode de biopsie bien qu’elle se limite à l’étude de l’équipement chromosomique de la mère, elle constitue un outil fiable, non invasif pour l’embryon. Les résultats obtenus par le groupe de Verlinsky et Kuliev (1996) en terme de succès / cycle chez la femme de plus de 35 ans sont de l’ordre de 20%.
La biopsie de globule polaire nécessite l’alignement dans le même plan équatorial du globule polaire et de la micrpipette d’aspiration. Une perforation est faite préalablement à l’aspiration du globule polaire au niveau de la zone pellucide de l’ovocyte. La perforation de la zone pellucide peut se faire soit par l’utilisation du Laser soit par le Tyrode acide. Aucun dommage n’a été observé pour les globules polaires isolés.

II. Biopsie sur l’embryon au stade 6-8 cellules (J3) par un prélèvement de 1 ou 2 blastomères

C’est le stade le plus utilisé pour établir un DPI par la majorité des centres. Cette technique nécessite comme pour la biopsie de globule polaire, de créer un trou dans la zone pellucide par l’utilisation de Tyrode acide ou du Laser. Toutes ces manipulations s’effectuent sous un microscope inversé. Après la perforation de la zone pellucide, une ou deux blastomères sont donc aspirées par la micropipettte d’aspiration dont le diamètre interne est de l’ordre de 35 µm et ensuite le ou les blastomères isolés seront mis dans une solution hypotonique (Kcl 75 mM) et ensuite fixés au fixateur composé d’un mélange d’éthanol et d’acide acétique. L’embryon biopsié sera remis en culture. Il est important de visualiser le noyau du blastomère sélectionné.
Apèrs la digestion, le noyau du blastomère sera localisé et pourra être analysés par les techniques de diagnostic : FISH ou PCR selon l’indication de DPI.
La biopsie se fait pour certain embryon en milieu de culture sans Ca++ et Mg++ afin de permettre une manipulation plus aisée car le blastomère se détache mieux.
A ce stade précoce, les cellules embryonnaires sont totipotentes et différentes études ont montré que le retrait d’une ou deux cellules n’affectent pas le developpement future de l’embryon. Un problème majeur de la biopsie à J3 est le nombre limité de cellules obtenues pour l’analyse.

III. Biopsie sur l’embryon au stade de blastocyste (J5-J6) par un prélèvement de cellules trophoblastiques

Les cellules trophoblastiques peuvent être obtenus au moyen d’une micropipette peforratrice ou par la méthode du Laser. En raison des difficultés de culture et de l’obtention des blastocystes, la biopsie de trophectoderme est peu réalisée malgré la grande fiabilité de cette technique où l’on peut prélever entre 15 et 25 cellules. Cependant, le développement des embryons jusqu’au stade blastocyste permet une sélection in vitro, ce qui devrait se traduire par un taux de grossesse plus élevé et l’expression des gènes embryonnaires étant donc déjà établie, il est possible alors de détecter des anomalies génétiques par des tests biochimiques. Les cellules du trophectoderme aspirées sont extraembryonnaires et contribuent à former le placenta après implantation. La biopsie n’a à priori aucune incidence sur le développement utérieur du foetus. Mais, des doutes peuvent être émises quant à la représentativité de l’embryon à partir des ces cellules ainsi que la possibilité d’un taux plus important d’anomalies dans celles-ci.
Effet du nombre d’ovocyte injectés et le nombre d’embryons biopsiables
Récemment, l’équipe Belge de Liebaers et Van Steirteghem (Vandervorst et al, 1998) ont montré que le taux de grossesse est corrolé au nombre d’ovocytes injectés et donc au nombre d’embryons biopsiables. L’étude porte sur 47 couples soit 84 cycles de DPI. Au total, 1140 ovocytes ont été récupérés soit en moyenne de 13,6 /ponction (2 à 43). Ils ont comparé le taux de grossesse selon le nombre d’ovocytes récupérés : groupe I nombre d’ovocytes est = 9 et groupe II nombre d’ovocytes = 9 :

Groupe I

groupe II

Nb d’ovocytes

<9

> 9

Nb de cycles de DPI

22

62

Nb d’ovocytes

124 (moyen: 5,6)

1020 (moyen: 16,5)

Nb de cycles avec embryon

18

59

Nb d’embryons biopsiés

2,23 ± 1,57

7 ± 4

Nb de cycles avec embryon transférés

14

54

Nb d’embryons transférés

0,77 ± 0,69

1,94 ± 1,05

Taux d’implantation

20%

13 %

Taux de grossesse /cycle

9% (2/22)

20,9% (13/62)


Egalement, dans cette étude, les autheurs ont trouvé une corrélation positive entre le nombre d’ovocytes récupérés et le nombre d’embryons biopsiés ainsi qu le nombre d’embryons génétiquement sains.
En conclusion, bien que le nombre d’ovocytes ne soit pas le seul critère selon lequel le succès de la tentative repose, mais il reflète la qualité de la stimulation ovorienne et donc la qualité de l’endomètre et donc il influence le taux d’implantation. À cela s’ajoute, le nombre d’embryons à biopsiés et donc le nombre d’embryons sains obtenus.

Références

Handyside AK, Pattison JK, Penketh RJA, Winston RML, and Tuddenham EGD (1989): Biopsy of human pré-implantation embryo and sexing by DNA amplification. Lancet II, 347-349
Handyside AK, Kontogiani EH, Hardy K and Winston RML (1990). Pregnancies fom biopsied human pré-implantation embryos sexed by Y specific DNA amplification. Nature, 344, 768-770
Penketh R. J. A., Delhanty J. D., Vanden Barghe J. A., Finkleston E. M., Hanyside A. H., Malcom S. and Winston R. M. L. (1989): Rapid sexing of human embryos by non-radiactive in situ hybridization: potential for preimplantation diagnosis of X-linked disorders. Prenatal Diagn., 9, 489-500
Vandervorst M, Liebaers I, Sermon K, Staessen C, De Vos A, Van de Velde H, Van Assche E, Joris H, Van Steirteghem A, Devroey P. (1998): Successful preimplantation genetic diagnosis is related to the number of available cumulus-oocyte complexes. Hum Reprod Nov;13 :3169-76.
Verlinsky Y, Kuliev A. Preimplantation polar body diagnosis (1996): Biochem Mol Med Jun; 58 :13-7
Verlinsky Y (1997): Clinical outcomes of pré-implantation diagnosis.Second international symposium on pré-implantation genetics. Chicago, Sebtember 18-21