Particularités
de la fécondation in-vitro en vue d’un diagnostic pré-implantatoire
Dr C.Rongières,
S.Viville, J. Ohl, K.Bettahar-Lebugle, C.Wittemer
Centre d’AMP Centre
médico-chirurgical et obstetrical Schiltigheim
Service de Gynécologie-Obstétrique Pr I.Nisand
1.Introduction
La prise
en charge d’un couple en vue d’un diagnostic pré-implantatoire (DPI) se plie
aux règles habituelles des couples infertiles mais est soumise à quelques contraintes
d’ordre technique. L’expérience belge nous a largement guidé et nous évite les
écueils dans lesquels ils sont eux-mêmes tombés à leur début.
Il ne faut pas perdre de vue que l’objectif est d’aider ces patients à avoir
un enfant même porteur, mais indemne de la pathologie transmissible. Cette condition
n’est pas en soi suffisante pour accepter en DPI tous les couples mêmes si les
techniques de dépistage existent. Le résultat de la tentative de FIV est primordiale
à double titre: elle permettra la naissance d’un enfant sain dans une famille
le plus souvent déjà blessée par une parentalité douloureuse et elle s’adresse
à des couples fertiles qui ont déjà obtenus des grossesses spontanément. Ces
couples sont transposés dans un univers qui leur est inconnu et qu’ils n’imaginaient
pas aussi complexe et incertain. Le screening des patients doit être sérié afin
d’éviter de les entraîner dans des procédures compliquées qui n’aboutiraient
pas de façon prévisible.
Le choix des techniques de laboratoire et les stratégies de transfert sont importantes
pour la qualité du DPI et l’amélioration des chances de grossesse tout en diminuant
les contraintes du biologiste responsable du diagnostic définitif.
2.Stratégie
d’inclusion en FIV en vue d’un DPI
La fécondation
in vitro (FIV) qui généralement permet l’obtention de plusieurs embryons offre
aux couples à risque de transmettre une maladie génétique d’établir le statut
génétique de leurs embryons et de ne transférer que les embryons sains ou porteurs
sains. Une cohorte suffisante d’embryons assure la présence d’au moins un embryon
sain. Cette nécessité d’obtenir plusieurs embryons est due à l’influence de
la pathologie sur le nombre d’embryons non atteints et transférables, à la perte
de matériel entre la ponction et le transfert et à l’influence du nombre d’embryons
sur le taux de grossesses. Vandervost et al (1998) ont très bien montré (Tableau
I) la corrélation entre la pathologie héréditaire et le nombre d’embryons non
atteints. De même le nombre de complexe cumulus ovocyte (CCO) est significativement
lié aux taux de grossesses (Tableau II) avec un taux croissant de grossesses
en fonction du nombre d’embryons transférés chez ces mêmes couples (Tableau
III), élément que l’on connaît bien en AMP. Liebears et al montrent que moins
de 50% des CCO obtenus donneront des embryons biopsiables (Tableau IV). Ainsi,
ce sera sur des critères classiques qu’il faudra sélectionner les patientes
avec une extrême vigilance puisque Vandervost propose l’annulation des cycles
à moins de 6 follicules espérés et qu’entre 6 et 8 l’annulation doit être discuter
avec le couple.
Tableau I :
Influence de la pathologie sur le nombre d’embryons non atteints et transférés
Pathologie
Héréditaire
|
Monogenic
recessif
|
Monogenic
dominant
|
Lié
à l’X
|
Sex-aneuploïdie
|
Cycles
(n)
|
29
|
33
|
14
|
8
|
CCO
(n)
|
405
|
398
|
221
|
116
|
E
Biopsiés (n)
|
133
|
202
|
111
|
40
|
E
normaux
|
84
|
35
|
35
|
18
|
E
normaux/CCO
|
0.21
|
0.16
|
0.16
|
0.15
|
Par
E biopsié
|
0.63
|
0.31
|
0.31
|
0.45
|
CEI
|
019
|
0.14
|
0.13
|
0.20
|
a,b
P<
0.00005 c P< 0.005 dP< 0.05 Vandervost et al Hum
Reprod 1998
CEI:
cycle efficiency index CCO: Complexe cumulus-ovocyte
Tableau II :
Caractéristiques des cycles quand < 9 et = 9 CC0 prélevés
Caractéristiques
|
Nbre
de CCO
|
|
< 9
|
=9
|
Nbre de cycles
(% du total)
|
22
a (26.1)
|
62
a (73.9)
|
Total de CCO
prélevés
|
124
|
1020
|
Nbre de cycle
avec E biopsiés (%)
|
18 (82)
|
59 (95)
|
Nbre d’E biopsiés
(±SD)
|
2.23 ± 1.57
b
|
7 ± 4
b
|
Nbre de cycles
avec TE (%)
|
14
c (63.6)
|
54
c (87)
|
Nbre d’E normaux/
CCO
|
0.14
|
0.18
|
Nbre de TE/cycle
(±SD)
|
0.77 ± 0.69
d
|
1.94 ± 1.05
d
|
Nbre d’E /transfert
(±SD)
|
1.21± 0.68
e
|
2.22 ±1.05
e
|
Implantation/E
(%)
|
20
|
13
|
Grossesses/cycles
(%)
|
2/22 (9)
|
13/62 (20.9)
|
a,b,d,eP<
0.0005 cP<0.05
Tableau III
: Influence du nombre d’embryons transférés sur le taux de grossesse
Nbre d’embryons
transférés
|
0
|
1
|
2
|
3
|
4
|
Nbre
de cycles
|
16
|
22
|
24
|
21
|
1
|
Nbre
de grossesses (%)
|
0 (0)
|
2 (10.1)
|
5 (18.1)
|
7 (33.3)
|
1 (100)
|
Tableau
IV:
Annulation des cycles (Liebears et al 1998 )
Moyenne
du nombre de CCO |
12.3
|
Ovocytes
Meta II |
10.9
|
Ovocytes
injectés |
10.6
|
2PN |
8.4
|
Embryons biopsiés |
5.8
|
<
de 50% des ovocytes donneront des embryons biopsiables
-
L’âge de la patiente est un facteur prédictif puissant
de bonne réponse aux stimulations de l’ovulation. Le déclin de la fertilité
commence à partir de 35 ans et à partir de 40 ans tous les aspects de la FIV
sont touchés malgré l’augmentation des doses: diminution du pic d’estradiol,
nombre de follicules recrutés, nombre d’ovocytes recueillis et taux de grossesses
significativement plus bas que chez des patientes jeunes. Pour Hull et col (1996)
le taux de naissances vivantes après transfert embryonnaire est de 32,2% entre
25 et 29 ans et de 8,8% entre 40 et 44 ans.
S’il est difficile de refuser d’emblée d’inclure une patiente en AMP pour âge
élevé (40-42 ans) cela l’est d’autant plus dans le cadre d’un DPI où les patientes
sont à priori fertiles.
- Les dosages hormonaux au troisième jour du cycle (J3) seront donc un
bon corollaire à l’âge pour prendre une décision. Le taux de FSH à J3 reste
le meilleur paramètre pour l’instant et le plus reconnu. Il existe une variabilité
des dosages en fonction des cycles et en fonction des laboratoires ce qui amène
à les contrôler au moins une fois. Un taux de FSH = 12 mUI/ml est considéré
comme pathologique mais chaque centre possède son seuil de référence en fonction
du laboratoire avec lequel il travaille. La FSH de base ne peut s’interpréter
sans la présence de l’estradiolémie à J3. Licciardi et al (1995) n’ont aucune
grossesse pour un estradiol supérieur à 75 pg/ml. Les taux d’estradiolémie sont
inversement proportionnels aux taux de FSH par effet de feed-back négatif. Ainsi
une FSH normale est faussement rassurante si on retrouve une estradiolémie élevée.
Cette proposition est vraie en dehors du syndrome des ovaires polykystiques
qui présentent une estradiolémie physiologiquement élevée.
L’inhibine B à J3 est un troisième marqueur qui commence à se répandre. Un taux
<= 45 pg/ml marque une insuffisance ovarienne débutante et d’après Siefer
et al (1999), serait diminuée avant l’augmentation de la FSH. De nouvelles études
discutent ces résultats rendant les taux de FSH de base seuls performants (Corson
et al 1999 )
- Les tests de réserve ovarienne peuvent contribuer à prendre une décision
dans les cas difficiles, en particulier chez des femmes entre 39 et 41 ans et
pour lesquelles les taux de base de FSH ou d’estradiol sont limites. Le test
au citrate de clomiphène (TCC) ou l’exogenous FSH ovarian reserve test (EFORT)
sont deux tests rapides, simples et qui permettent d’évaluer la réponse de l’ovaire
à la stimulation. Une élévation de la FSH à J3 et à J10 à plus de 10mUI/ml après
traitement de 5 jours de 100 mg de CC ou un delta < 30 pg/ml d’estradiol
entre J3 et J4 et après 300 UI de FSH à J3 mettent en évidence une insuffisance
ovarienne qui ne répondra pas au traitement de stimulation de l’ovulation. Chez
des patientes jeunes cependant une élévation de la FSH ne doit pas faire reculer
devant une tentative de FIV. Certaines études montrent un taux de réussite cumulée
satisfaisant mais seulement dans le cadre de l’infertilité où le but est l’obtention
d’une grossesse même avec un faible recueil ovocytaire. La nécessité d’obtenir
un nombre suffisant d’embryons pour aboutir à un transfert change considérablement
les données du problème.
Ainsi, un bilan mettant en évidence une patiente qui répondrait peu ou pas à
une stimulation d’ovulation en vue d’un DPI doit amener à rediscuter l’indication
et éventuellement à ne pas l’intégrer dans un protocole (C.Rongières-Bertrand
et al 1997)
-
L’imagerie permet d’objectivé la qualité de la cavité utérine et donc de
l’accueil de l’embryon, ce d’autant qu’il existe des antécédents de curetage
ou de fausse couche tardive. L’hystéroscopie est supérieure à l’hystérographie
pour diagnostiquer les petites lésions intra utérines (polypes, myomes, synéchies)
et les pathologies de la muqueuse (hyperplasie, atrophie, endométrite). Un traitement
chirurgical adéquat sera proposé avant tout traitement de stimulation.
- Le spermogramme est à demander même si l’ICSI est la technique de choix
pour un DPI. Il permet d’éviter les mauvaises surprises le jour de la ponction
(OATS sévère, azoospermie) et si besoin de rechercher des anomalies génétiques
ou autres devant des pathologies découvertes à ce moment là (caryotype parental,
anticorps antispermatozoïdes, infection).
3.Choix de
la stimulation
Le choix
de la stimulation doit se faire en fonction du profil hormonal de la patiente
comme dans une AMP classique. Il n’y a pas de légitimité à proposer une hyperstimulation
de l’ovulation contrôlée « forcée ». Les risques d’hyperstimulation
sont vrais également pour ces patientes. Il s’agit plutôt d’adapter le traitement
afin d’obtenir environ une dizaine follicules. L’existence de trois centres
de DPI en France amène les gens à consulter loin de chez eux. Les centres d’AMP
locaux font relais et permettent le déplacement des patientes juste pour le
jour de la ponction ovocytaire. Il est souvent plus facile pour le centre qui
effectue le DPI de prescrire le traitement de stimulation et de le monitorer
avec le centre relai. Ceci permet de fixer ensemble les dates de début de traitement,
de suivre les monitorages sur des traitements connus et ainsi de pouvoir annuler
à distance avant de déplacer les patients. L’échec de stimulation ou l’annulation
du traitement est alors sous la responsabilité du centre de DPI, ce qui facilite
la relation triangulaire patient, centre relais et centre DPI.
4. Choix
de l’ICSI
La technique
de l’injection intracytoplasmique de spermatozoïde (ICSI) est aujourd’hui la
technique de choix pour un DPI. La PCR en général et en particulier sur une
ou deux cellules nécessite minutie et vigilance. Il s’agit d’éviter toute contamination
par de l’ADN extérieur: en particulier celui de l’opérateur, l’ADN volatile
des PCR antérieures mais aussi les cellules du cumulus ou d’autres spermatozoïdes
qui peuvent venir polluer le prélèvement de blastomère si l’embryon a été fécondé
en fécondation in vitro classique.
A ces critères se rajoutent également la diminution du risque d’échec de fécondation.
Staessen et al (1999) montrent qu’il existe un petit avantage à l’ICSI en minimisant
les risques d‘échecs de fécondation sans oblitérer les chances de développement
embryonnaire et d’implantation potentielle. (Tableau V )
Tableau V : Fertilisation à 2PN dans une cohorte d’ovocytes traités
par FIV ou ICSI
|
FIV
(n=334)
|
ICSI
(n=328)
|
|
Tous Patients
(n=56)
N° de CCO
|
6.0 ± 2.2
|
5.9 ± 2.3
|
|
2PN/CCO
(%)
|
53.0
± 31 .2
|
62.0
± 26.6
|
NS
|
Sans EF (n=47)
N° de CCO
|
6.1
± 2.2
|
5.9
± 2.3
|
|
2PN/CCO
(%)
|
60.3
± 25.6
|
63.8
± 25.2
|
NS
|
Avec EF
en FIV (n=7)
N° de CCO
|
5.9 ± 1.8
|
6.2 ± 1.9
|
|
2PN/CCO
(%)
|
-
|
69.2
± 15.3
|
|
Avec EF en ICSI (n=2)
N° de CCO
|
4.0
± 1.4
|
3.5
± 0.7
|
|
2PN/CCO
(%)
|
56.6
± 33.0
|
-
|
|
EF : échec de fertilisation
5.Le transfert
embryonnaire
Le diagnostic
pré implantatoire se fait en général à J3 de la culture embryonnaire dans le
but d’obtenir un embryon entre 4 à 8 cellules pour un diagnostic par PCR ou
FISH au mieux sur deux blastomères d’un même embryon. Grifo et al (1998) ont
transféré à J4 après un DPI par PCR effectué le 3ème jour. Ils ont retrouvé
sur 7 couples intéressés, un taux de d’implantation de 37,5% avec un taux d’enfant
vivant / transfert de 25% dont une grossesse gémellaire. Ils concluent qu’il
n’y a pas d’effets adverses au transfert à J4 alors qu’il existe non seulement
une plus grande sécurité au diagnostic génétique mais aussi une possibilité
d’augmenter le nombre de recherches possibles du fait du temps imparti au biologiste.
De plus ils soulignent l’augmentation de taux d’implantation bien qu’il s’agisse
d’une petite série.
Gianarolli et al (1999) ont effectué chez 86 patientes de mauvais pronostic
(échecs répétés d’implantation, indication de caryotype pour âge maternel, translocation)
116 cycles de FIV. Deux groupes ont été individualisés; le groupe 1 qui a bénéficié
d’un transfert à J3 en fin d’après midi avec une analyse par FISH des chromosomes
XY, 13,16,18 et 21 et un deuxième groupe dont les embryons ont été transférés
à J4 le matin avec une analyse par FISH des chromosomes précédents plus le 14,15
et 22. Cette technique se faisait alors en deux temps. (Tableau VI). Leurs conclusions
sont similaires à l’équipe de Grifo avec un commentaire supplémentaire développant
le bénéfice en terme de sélection d’embryons sains et viables à J4 sans contrainte
de temps pour le biologiste comme pour la patiente.
Tableau VI :
Devenir des embryons biopsiés congelés ou non congelés
|
Embryons
biopsiés
|
Embryons
non biopsiés
|
Nombre
de patientes
|
30
|
43
|
Age (année ;
moyenne ±SD)
|
36.3
± 3.7
|
36.1
± 2.8
|
Nombre
d’embryons décongelés
|
55
|
94
|
Intacts
(%)
|
5a
(9)
|
24a
(25)
|
Lysés (%)
|
19b
(34)
|
12b
(13)
|
Index de
survie %
|
38c
|
61c
|
ac
2= 4.98 ; P<0.025
bc 2 = 8.71 ; P<0.001
cc =48.11 ;P<0.001
|
|
|
Veiga
et al (1999) ont publié les résultats de trois patientes dont le DPI a été fait
à J3 et le transfert entre J5 et J6. Leurs résultats montrent l’absence de dommages
de la biopsie embryonnaire sur le développement embryonnaire jusqu’au stade
blastocyste. De plus, ils évoquent la possibilité d’un DPI à J5 permettant l’obtention
de plus de matériel. On sait qu’il peut exister des mosaïques avec aneuploïdies
à ce stade sans connaître encore leur conséquence pathologiques et la capacité
de réparation de ces embryons (Wells et al 2000).
Les transferts en France sont actuellement réalisés à J3 en fin d’après midi.
La littérature préconise les transferts à J4 et il n’est pas impossible qu’un
transfert à J5-j6 après maîtrise de la culture prolongée soit un jour proposé.
Comme il n’y a pas de légitimité à hyperstimulation forcée, il n’y a pas de
légitimité à transférer plus de deux embryons chez ces femmes en général fertiles.
La politique de transfert doit rester la même qu’en AMP classique pour éviter
à ces couples des grossesses multiples. Les grossesses multiples chez ces patientes
présentent les mêmes risques que chez les autres avec la certitude actuellement
d’un diagnostic génétique anténatal pour confirmer le DPI. L’amniocentèse n’est
pas sans risque supplémentaire dans ces grossesses.
6.
La congélation embryonnaire
La
congélation des embryons sains surnuméraires n’a pas aujourd’hui donné de résultats
satisfaisant. Van Steitegheim n’a aucune grossesse après transfert d’embryons
sains biopsiés ayant subit un cycle de congélation-décongélation. Magli et al
(1999) ont comparé des embryons après décongélation. Le groupe 1 comprenait
55 embryons biopsiés décongelés et le groupe 2 comprenait 94 embryons sans biopsies
décongelés. Le pourcentage d’embryons intacts après décongélation est significativement
plus élevé dans le groupe 2 (25% vs 9% ;P<0.025). Ils décrivent un index
intéressant : l’index de survie qui correspond au nombre de blastomères
vivants divisés par le nombre de blastomères totaux congelés. Cet index est
significativement plus élevé dans le groupe 2 (61% vs 38% ; P< 0.001.
Dans un deuxième temps, ils ont analysé par FISH des embryons qui avaient été
congelés pour hypestimulation ovarienne. Ils ont été décongelés puis biopsiés
puis transférés. Ils retrouvent 52% d ‘aneuploïdie, 19% (3/19) de grossesses
évolutives et 10% d’implantation. Les auteurs préconisent qu’à l’heure actuelle
il est préférable de ne pas congeler les embryons biopsiés jusqu’à la mise au
point d’un protocole congélation-décongélation qui soit approprié et qui passerai
par une ouverture de la zone pellucide moins agressive. Ludwig et al (1998)
ont montré chez la souris, que congélation et biopsie sont possible.
Aujourd’hui, la congélation peut être conseillée aux couples avec toute la prudence
nécessaire dans les chances de réussite.
7.Conclusion
Le DPI
est possible du fait de l’acquisition de plusieurs embryons en FIV ouvrant la
probabilité d’obtenir un embryon sain au moins. Les choix des techniques de
fécondation et de congélation sont intimement liés à la performance du DPI.
Les inclusions en vue d’un DPI , le choix de stimulation et de transfert
doivent être soumis à une réflexion drastique plus encore que dans le cadre
de l’infertilité. L’écoute du couple à tous ces endroits doit être supportée
par des psychologues mais également par les cliniciens et généticiens de l’équipe.
La contrainte d’un traitement de stimulation en FIV n’est pas sans effet sur
la représentation déjà ébranlée de leur capacité à se reproduire.
Bibliographie
Corson
S.L, Gutmann J, Batzer F.R, Wallace H, Klein N, Soules M.R Inhibin-B as a test
of ovarian reserve for infertile women 1999 Hum Reprod;14: 2818-2821
Gianaroli L, Magli M.C, Munné S, Fortini D, Ferraretti A Advantages of day 4
embryo transfer in patients undergoing preimplantation genetic diagnosis of
aneuploidy 1999 J Assis. Reprod Gen 16:170-175
Grifo J.A, Giatras K, Tang X.T, Krey L Successfull outcome with day 4 embryo
transfer after preimplantation diagnosis for genetically transmitted diseases
1998 Human Reprod 13; 1656-1659
Hull M.G.R, Fleming C.F, Hughes A.O, Mc Dermott A The age-related decline in
female fecundity: a quantitative controlled study of implanting capacity and
survival of individual embryos after in vitro fertilization 1996, Fertil Steril;
65: 783-790
Licciardi F.L, Liu H.C, Rosenwaks Z Day 3 estradiol serum concentration as pronosticators
of ovarian stimulation response and pregnancy outcome in patients undergoing
in vitro fertilization 1995, Fertil Steril; 64: 991-994
Liebaers I, Sermon K, Staessen C, Joris H, Lessius W, Mc Asshe E, Nagy P, Vandervost
M, devroey P, Van Steirtegheim A Clinical experience with preimplantation diagnosis
and intracytoplasmic injection 1998, Hum Reprod 13:186-195
Ludwig M, Muschalla H, Al-Hasani S, Diedrich K The effect of multiple cryopreservatin
procedures and blastomere biopsy on the in-vitro development of mouse embryos
1998, Hum Reprod, 13: 3165-3168
Magli M.C, Gianaroli L, Fortini D, Ferraretti A.P, Munné S Impact of blastomere
biopsy and cryopreservation techniques on human embryo viability 1999, Hum Reprod,
14; 770-773
Rongières –Bertrand C, Olivennes F, Fernandez H, Fanchin R, Righini C, Hazout
A, Glissant M, Frydman R
Rôle pronostic de l'âge et des dosages hormonaux de base dans le traitement
de l'infertilité 1997
Contr. Fertil, Sex , 25, 202-205
Seifer D.B, Scott R.T,Bergh P.A, Abrogast L.K, Friedman C.I, Mack C.K, Danforth
D.R Women with declining ovarian reserve may demonstrate a decrease in day 3
serum inhibin B before a rise in day 3 follicle-stimulating hormone 1999; Fertil
Steril, 72: 63-65
Staessen C, Camus M, Clasen K, de Vos A, Van Steirteghem A Conventionnal in-vitro
fertilization versus intracytoplasmic sperm injection in sibling oocytes from
couples with tubal infertility and normozoospermic semen 1999 Hum Reprod 14:2474-2479
Vandervost M, Liebaers I, Sermon K, Staessen C, De Vos A, Van de Veld H, Van
Assche E, Joris H, Van Steiteghem A, Devroey P Successful preimplantation genetic
diagnosis is related to the number of available cumulus-oocyte complexes 1998
Hum Reprod 13;3169-3176
Veiga A, Gil Y, Boada M, Carrera M, Vidal F, Boiso I, Menezo Y, Barri P.N Confirmation
of diagnosis in preimplantation genetic diagnosis (PGD) thorugh blastocyst culture:
preliminary experience 1999 Prenat. Diagn. 19;1242-1247
Wells D, Delhany J.D.A A novel methodology allows detection of every chromosome
in single blastomeres from human preimplantation embryos and reveals aneuploidy,
mosaicism and unformly normal embryo 21-26 Octobre 2000, Oral Presentation(0-001),
56th annual meeting of the American Society for Reproductive Medecine
, San Diego, USA
|