DIAGNOSTIC ANTENATAL : PEUT-ON ENVISAGER UNE PLACE SIGNIFICATIVE POUR LA RECHERCHE DE CELLULES FOETALES DANS LE SANG CIRCULANT MATERNEL AU SEIN DES TECHNIQUES ACTUELLES

* Service de Gynécologie-Obstétrique et Médecine de la Reproduction, Hôpital Tenon, 4 rue de la Chine 75020 PARIS

UPRES Physiologie de l'Implantation et du développement, Hôpital Tenon

** Service de Gynécologie-Obstétrique, Hôpital Jean Verdier, Avenue du 14 Juillet, 93143 BONDY Cedex

INSERM U 361

L'extension des indications du dépistage anténatal des anomalies chromosomiques ou génétiques a conduit à la diversification des moyens mis en œuvre mais ayant en commun trois objectifs :

- une meilleure spécificité combinée à une meilleure sensibilité.

- Un caractère de moins en moins invasif des examens nécessaires.

- Un coût de plus en plus réduit pour pouvoir étendre le nombre de patientes explorées.

En fait ce triple objectif conduit à distinguer deux catégories de tests :

* des tests de dépistage qui avec une sensibilité de 50 à 70 % conduisent à 5 % d'amniocentèses. Ces tests sont essentiellement représentés par les tests biochimiques (simple, double, ou triple test combinant différentes formes d'HCG, d'alpha-foeto protéines et d'oestriol). On rapproche de ces tests biochimiques l'échographie qui a des objectifs similaires (40 à 60 % de sensibilité pour la trisomie 21).

* Des tests diagnostiques : il s'agit de l'amniocentèse, de la biopsie de trophoblaste, de la cordocentèse, de la placentocentèse qui sont des tests de diagnostic direct mais qui présentent tous (bien qu'à des degrés divers) une morbidité liée à leur caractère invasif. Ces tests invasifs ne peuvent être réservés qu'aux patientes présentant un risque " significatif " d'anomalie chromosomique. Mais si l'on se souvient que 80 % des mères donnant naissance à une trisomie 21 ont moins de 38 ans on comprend la nécessité de tests applicables à une large population !

La mise en évidence de cellules fœtales dans le sang circulant maternel nous a laissé (avec plus d'optimisme il y a quelques années) entrevoir la possibilité de respecter les 3 objectifs cités plus haut avec à partir d'un test (un prélèvement de sang périphérique maternel) non invasif des résultats quasi parfaits.

La présence de cellules fœtales dans le sang circulant maternel a longtemps été supposée, mais n'a été confirmée que récemment en raison de leur nombre extrêmement réduit . Ce n'est qu'au cours des dix dernières années que des techniques de Biologie Moléculaire ont permis en améliorant la sensibilité de nos tests de confirmer leur présence dans le sang circulant maternel. Fort logiquement il a paru ensuite nécessaire de développer des techniques d'enrichissement permettant d'analyser un nombre suffisant de cellules fœtales. Ces techniques d'enrichissement ont déjà permis la mise en évidence de trisomie fœtale par des cellules extraites du sang circulant maternel. La conclusion de ces recherches paraissait si " proche " qu'en 1994 le National Institute for Child Health and Human Development commandita un essai de phase II pour évaluer la pertinence du diagnostic chromosomique à partir de cellules fœtales. Ce protocole concerne (il est en cours) la mise en évidence chez des patientes présentant un facteur de risque (âge ou autre) d'une aneuploïdie des chromosomes 13, 18, 21,X et Y. 3000 femmes doivent être incluses et le protocole (qui analyse l'impact psychologique de ce dépistage) doit parvenir à son terme en 1998.

L'amplification de séquences de DNA spécifique du fœtus dans les échantillons sanguins maternels constitue le meilleur test pour évaluer le nombre relatif de cellules fœtales présentes dans le sang circulant maternel. La technique la plus couramment utilisée qui est la polymerase chain reaction (PCR) est capable de détecter des cellules présentes à un taux variant de 105 à 10 6 cellules maternelles. Ce taux correspond à la " dilution " minima détectable. La recherche la plus couramment réalisée porte sur des séquences du chromosome Y avec des grossesses de fœtus masculin. Ces séquences ont été mises en évidence aux 3 trimestres de la grossesse. D'autres auteurs ont préféré détecter la présence de séquences Rhésus D chez des mères Rhésus D négatives ayant des fœtus Rhésus positif. Il est important de bien analyser le moment où a été réalisé le prélèvement lorsque des séquences d'ADN spécifique fœtale ont été mises en évidence. En effet si le prélèvement sanguin maternel a été réalisé après des procédures invasives on peut toujours craindre qu'il s'agit d'un passage de cellules fœtales dans le sang circulant maternel lié au geste. C'est semble-t-il le cas de certaines observations décrites avec des séquences de fœtus Rhésus positif.

A partir de l'analyse de plusieurs publications on peut évaluer le pourcentage de cas de cellules fœtales détectables à différents moments de la grossesse. Ces cellules fœtales peuvent être mises en évidence 4 semaines après l'implantation (6 semaines d'aménorrhée) dans près de 30% des grossesses. Ce taux augmente nettement entre la 8e et la 13e semaine pour atteindre 80 % de grossesses avec cellules fœtales présentes. Il faut toutefois considérer ces chiffres avec la plus grande prudence car ils portent sur un nombre limité de cas. On exprimera ce résultat d'une autre façon en calculant le nombre de cellules fœtales présentes pour le nombre de cellules maternelles à analyser. Ce taux varie de 1 pour 500 000 cellules à 1 pour 1,5 million . En d'autres termes un échantillon sanguin maternel de 10 ml pourrait contenir 60 à 200 cellules fœtales. Ces chiffres ont été retrouvés par des moyens différents par d'autres auteurs ayant une grande expérience sur ce sujet comme Holzgreve ou Bianchi. Cette dernière précise même que selon ses résultats elle ne retrouve que rarement plus de 100 cellules fœtales pour un échantillon maternel de 10 ml.

Toutes les questions que nous venons d'évoquer n'ont pas tenu compte d'un des risques bien connu de la PCR qui est celui de l'amplification de séquences parasites pouvant donner des résultats faussement positifs. Il faut toutefois noter que l'amélioration récente des techniques mises en œuvre a permis de réduire ce risque très largement.

Quoi qu'il en soit il est clairement possible pour un certain nombre de grossesses avec une fréquence variant de 30 à 80 % de mettre en évidence des cellules fœtales dans le sang maternel. Le nombre de ces cellules est toutefois trop réduit pour (dans la majorité des cas) pouvoir analyser directement le matériel obtenu et la plupart des auteurs pensent que des techniques d'enrichissement en cellules fœtales sont nécessaires. Nous évoquerons plus loin ces techniques d'enrichissement.

On peut retrouver dans le sang circulant maternel différents types de cellules fœtales : des cellules trophoblastiques, des globules blancs, des plaquettes (qui du fait de l'absence de DNA génomique n'ont pas d'intérêt dans le cas présent), des globules rouges, en sachant que parmi ceux-ci les plus intéressants sont ceux qui sont encore nucléés c'est à dire les erythroblastes et également des cellules souches. Parmi les facteurs pouvant influencer le nombre de cellules fœtales présentes dans le sang maternel on peut citer : le type de placentation, l'existence d'une grossesse multiple, la lyse d'un embryon, la compatibilité sanguine materno fœtale et certaines complications maternelles telles que diabète, métrorragies, prééclampsie. L'existence d'une anomalie cytogénétique fœtale augmente le nombre de cellules fœtales présentes dans le sang maternel. Cet élément confirme que le type de placentation et la réponse immunitaire à la grossesse sont différents en cas d'anomalie fœtale. Le nombre de cellules fœtales présentes pourrait constituer un élément diagnostic en cas de grossesse pathologique telle que la Pré-Eclampsie. Un autre facteur influençant le nombre de cellules fœtales présentes a déjà été évoqué, c'est le type même de cellules considérées.

Des lymphocytes ont été retrouvés jusqu'à 5 ans après l'accouchement. Ce fut également le cas pour des cellules trophoblastiques. Ce fait ajouté à l'existence de phénomènes de chimerisme induit par la grossesse doit conduire à une interprétation très prudente de certains résultats. Ces inconvénients n'existent pas à priori avec les erythroblastes.

Bien que de très nombreuses cellules trophoblastiques (le chiffre est voisin de 100 000) soient relarguées chaque jour dans la circulation maternelle, très peu atteignent la circulation périphérique car la majorité des cellules syncytio-trophoblastiques multinuclées sont filtrées et stoppées au niveau du poumon maternel. Plusieurs observations erronées de cellules trophoblastiques ont été publiées à partir de leucocytes maternels contenant des Antigènes trophoblastiques.

Comme on le sait la pré-éclampsie est en partie rattachée à l'absence d'invasion trophoblastique de la couche musculaire de la portion intra myométriale des artères spiralées. Sans s'étendre sur les causes de ce défaut d'invasion une étude comparant la présence de cellules trophoblastiques au niveau des vaisseaux périphériques et utérins de patientes présentant une grossesse normale et compliquée de pré-éclampsie, a démontré qu'il existait de façon significative moins de cellules trophoblastiques chez les patientes développant une pré-éclampsie. Il faut noter également que les techniques d'enrichissement sont beaucoup plus difficiles à mettre en œuvre avec les cellules trophoblastiques, ce qui fait de ces cellules des candidates improbables à l'étude génétique dans le sang périphérique maternel. Rappelons enfin que les travaux de Hustin avaient démontré que l'espace inter-villeux n'est pas entouré de sang circulant maternel durant les 12 premières semaines de la grossesse, ce qui explique le nombre très réduit ou absent de cellules trophoblastiques avant le 3e mois de grossesse. Ces constatations semblent toutefois devoir être revues à la lumière de publications récentes d'auteurs telles que A. Kurjac ayant mis en évidence très précocement des flux sanguins (observés en Doppler vitesse lente) dans l'espace intervilleux. Le problème majeur avec les cellules trophoblastiques est leur possible " remanence " d'une grossesse à l'autre. Un autre inconvénient est représenté par leur caractère multinucléé et la possibilité de mosaïques limitées au placenta : dans 1 % des cas le caryotype placentaire diffère du caryotype réel du fœtus. Malgré tous ces inconvénients plusieurs travaux ont concerné ces cellules.

III .LEUCOCYTES DANS LA CIRCULATION MATERNELLE

Pour mettre en évidence la présence de lymphocytes dans le sang circulant maternel, la technique la plus couramment utilisée consiste à identifier les anticorps spécifiques d'Antigène HLA paternel. Outre que les résultats obtenus sont assez décevants, il faut rappeler que la production de lymphocytes fœtaux débute à 20 semaines de grossesse en même temps que le développement de la moelle osseuse fœtale. Si différents auteurs ont pu avec succès mettre en évidence des séquences HLA paternel ou des séquences Y spécifiques par F.I.S.H. technique, les résultats obtenus assez tardivement au cours de la grossesse sont assez inconstants et là aussi ne constituent pas une voie encourageante pour l'étude des cellules fœtales. A titre d'exemple les Antigènes de surface des lymphocytes sont peu différents de ceux des lymphocytes maternels. Par ailleurs les lymphocytes peuvent également persister longtemps après l'accouchement (jusqu'à 5 ans).

Les erythroblastes ont la caractéristique d'être présents précocement dans le sang circulant fœtal, de disparaître très rapidement dans le sang circulant adulte, et d'avoir une durée de vie d'environ 90 jours. Ce dernier point est particulièrement intéressant car il permet de ne pas craindre la présence de cellules fœtales liées à une grossesse antérieure. Ces différentes caractéristiques ont fait de ces cellules le candidat idéal à la détection et à l'enrichissement des cellules fœtales dans le sang circulant maternel. La présence d'erythroblastes est facilitée par le fait que la plupart des mères ont une compatibilité sanguine avec leur fœtus. C'est d'ailleurs à partir de ce type de cellules que furent réalisés les premiers cas de mise en évidence de trisomie fœtale dans le sang circulant maternel. De très nombreuses techniques d'enrichissement ont été utilisées concernant ces cellules. Elles diffèrent les unes des autres par leur coût et le temps nécessaire à leur réalisation.

Sans entrer dans le détail de ces techniques qui pourront être retrouvées dans une bibliographie abondante sur ce sujet il semble aujourd'hui admis que les erythroblastes peuvent être enrichis et retrouvés de façon significative aux trois trimestres de la grossesse dans la circulation maternelle.

Même si ces cellules ne sont plus détectables à distance de l'accouchement les résultats restent encore inconstants et imparfaits ne permettant pas leur utilisation en pratique courante. Les programmes actuellement en cours comparant différentes techniques, différents anticorps utilisés et différentes techniques d'enrichissement devraient permettre d'obtenir des résultats concluants dans les années qui viennent.

Là aussi sans entrer dans des détails techniques trop sophistiqués on peut résumer cette question en décrivant les deux principales techniques utilisées que sont la PCR et l'hybridation in situ (fluorescence in situ hybridation : FISH).

* La PCR : rappelons simplement que cette technique a pour objet de mettre en évidence des séquences spécifiques du fœtus concernant soit le chromosome Y soit le gène Rhésus, soit des gènes HLA d'origine paternelle. Elle a également été utilisée pour mettre en évidence des séquences spécifiques du trophoblaste.

Toutefois le nombre réduit de cellules même après technique d'enrichissement limite cette technique de PCR au diagnostic soit de maladie génétique de type autosomique dominante où le père est porteur de la mutation; soit aux affections autosomiques récessives où la mutation maternelle et la mutation paternelle sont différentes l'une de l'autre. Cette technique peut également être utilisée lorsque le gène n'a pas été clairement identifié mais par la recherche de polymorphismes liés aux gènes de la maladie.

D'autres techniques sont en cours de développement pour améliorer la sensibilité et la spécificité de cette technique par des tris cellulaires incluant des micro-manipulations. Ces techniques doivent être encore largement améliorées pour être couramment utilisées.

* L'hybridation in situ : FISH

Cette technique peut détecter des aneuploïdies sur des noyaux en interphase. Elle a été utilisée sur des erythroblastes triés dans la circulation maternelle . La sensibilité de cette technique est encore insuffisante et là aussi des travaux sont en cours pour essayer d'augmenter le pourcentage de cellules fœtales détectées dans le sang circulant maternel. Ces techniques d'enrichissement font appel pour certaines à l'utilisation d'anticorps spécifiques de l'hémoglobine fœtale.

Toutes ces techniques se caractérisent par le nombre de cellules et la pureté des échantillons. A titre d'exemple dans un travail particulièrement bien mené les résultats furent 52 cellules et des index de pureté variant de 0.015 % à 4.8 %.

CONCLUSION : 

Les cellules fœtales peuvent être mises en évidence dans la circulation maternelle et leur nombre peut être augmenté (enrichi) par différentes techniques qui sont encore en cours de développement pour la plupart. Quoi qu'il en soit il semble d'ores et déjà que l'erythroblaste soit la cellule fœtale la plus intéressante à mettre en évidence dans le sang circulant maternel non seulement du fait du nombre de cellules mais également du fait que ces cellules présentes dès le premier trimestre de la grossesse disparaissent assez rapidement après l'accouchement évitant ainsi des erreurs liées à des cellules présentes d'une grossesse à l'autre.

Les résultats actuellement disponibles sont suffisamment prometteurs pour indiquer qu'à coup sûr (mais avec quel délai ?) des techniques sensibles et relativement spécifiques de diagnostic chromosomique et génétique fœtal seront accessibles à partir de cellules fœtales isolées dans le sang circulant maternel. Les techniques de tri cellulaire semblent très prometteuses puisque dans des observations de diagnostic pré implantatoire une seule cellule a pu conduire au diagnostic. Des manipulations sur un seul erythroblaste ont déjà été réalisées. Gageons que cette technique sera certainement dans les années à venir un élément clé du diagnostic prénatal.

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