Analyse de l'apoptose
dans les spermatozoïdes
d'hommes porteurs
de translocations
chromosomiques

G. TACHDJIAN

Introduction

L'infertilité masculine est associée à des altérations des paramètres spermatiques. Les anomalies spermatiques peuvent être dues à des causes infectieuses, environnementales, traumatiques, malformatives et génétiques. Différentes étiologies génétiques de l'infertilité masculine ont été décrites telles que les mutations du gène CFTR, le syndrome de Klinefelter, les translocations chromosomiques et les microdélétions du chromosome Y. Chez les hommes infertiles, la fréquence des anomalies chromosomiques est augmentée. Parmi ces anomalies chromosomiques, les translocations Robertsoniennes et les anomalies des gonosomes sont les plus fréquentes. Les hommes porteurs d'une translocation produisent un pourcentage significatif de spermatozoïdes avec une combinaison déséquilibrée de la translocation, à l'origine d'un risque plus ou moins important de déséquilibre pour leur descendance (Frydman et al., 2001).

Actuellement, les mécanismes qui déterminent la qualité génétique des gamètes sont peu connus. Certains facteurs génétiques tels que l'apoptose peuvent être impliqués dans le processus méiotique dans les cellules germinales. De récentes études ont montré que l'apoptose constitue un des principaux mécanismes physiologiques de régulation durant la spermatogenèse chez les Mammifères (Print et Loveland, 2000). L'apoptose est déclenchée par différents stimuli et se traduit au niveau cellulaire par une activation d'une cascade enzymatique, la voie des caspases, endonucléases qui génèrent des fragments d'ADN double brin de 200 paires de bases, présentant des extrémités 3'-OH libres. L'apoptose dans le sperme humain peut ainsi être étudiée par la détection des fragments de l'ADN spermatique (Sun et al., 1997). Chez l'homme, des fragmentations de l'ADN sont physiologiquement présentes à certains stades de la spermatogenèse (Sakkas et al., 1995). La présence de coupures de l'ADN dans les spermatozoïdes éjaculés serait le reflet d'une spermatogenèse anormale. Par la méthode TUNEL, une augmentation de spermatozoïdes avec ADN fragmenté est observée dans des populations d'homme infertiles (Sun et al., 1997; Gandini et al., 2000; Zini et al., 2001; Benchaib et al., 2003).

Dans le but de déterminer une corrélation entre les anomalies chromosomiques et l'apoptose dans les spermatozoïdes humains, nous avons analysé la fragmentation de l'ADN spermatique et la ségrégation méiotique chez des hommes porteurs d'une translocation Robertsonienne (13;14).

Matériels et méthodes

Sujets

Douze hommes porteurs d'une translocation chromosomique Robertsonienne entre les chromosomes 13 et 14 ont été inclus dans cette étude. Leur caryotype était 45,XY,der(13;14)(q10;10). L'âge moyen de ces 12 hommes était de 33,9 ± 3,85 ans (26 à 41 ans). Le délai d'abstinence sexuelle, la prise de toxiques médicamenteux et la survenue d'un épisode infectieux dans les trois mois précédents ont été notés.

Neuf hommes fertiles ayant un caryotype normal (46,XY) et des caractéristiques spermatiques normales ont été utilisés comme population contrôle. L'âge moyen de ces 9 hommes était de 34,6 ± 5,2 ans (28 à 44 ans). Tous ces hommes ont été à l'origine d'une grossesse dans les deux années précédentes.

Caractéristiques spermatiques

Après recueil du sperme par auto-masturbation dans un réceptacle stérile et liquéfaction à température ambiante, les paramètres spermatiques suivants ont été analysés : volume et pH de l'éjaculât, concentration, mobilité progressive rapide, lente et non progressive et vitalité des spermatozoïdes. La morphologie des spermatozoïdes a été analysée après coloration de Schorr.

Etude de l'apoptose dans les spermatozoïdes

L'apoptose a été analysée par l'étude de la fragmentation de l'ADN par la technique TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated fluorescein-dUTP nick end labeling) dans les spermatozoïdes éjaculés.

Dix microlitres de la suspension de spermatozoïdes ont été étalés sur une lame de verre. Les solutions contenant l'enzyme Terminal desoxyribonucleotid Transferase (Roche, Meylan, France) et les nucléotides marqués ont été déposés sur les spermatozoïdes et les lames ont été recouvertes d'une lamelle. La réaction de polymérisation des nucléotides au niveau des extrémités 3'-OH libres de l'ADN a été réalisée dans une chambre humide à 37° C et à l'obscurité pendant une heure. Les lames ont été ensuite lavées trois fois dans une solution de PBS 1X pendant deux minutes à température ambiante.

Les noyaux des spermatozoïdes ont été contre-colorés avec une solution de 4',6-diamino-2-phényl indole (DAPI). La lecture de la fragmentation de l'ADN a été réalisée en microscopie à épifluorescence avec un filtre spécifique pour la fluorescéine. Le pourcentage de fragmentation d'ADN a été défini comme le rapport du nombre de spermatozoïdes fragmentés sur le nombre total de spermatozoïdes analysés. Le pourcentage de spermatozoïdes présentant un ADN fragmenté a été calculé à partir de l'analyse de 1000 spermatozoïdes quand les paramètres spermatiques le permettaient.

Etude de la ségrégation méiotique

Une hybridation in situ fluorescente (FISH) double couleur a été réalisée en utilisant des sondes d'ADN spécifiques des chromosomes 13 et 14. Ces sondes ont été préparées à partir de clones de chromosomes artificiels de bactéries. Le marquage des sondes a été réalisé par nick translation avec la fluorescéine 12 d-UTP (Roche) pour le chromosome 13 et avec la Rhodamine 6-dUTP (Roche) pour le chromosome 14.

Les lames ont été analysées en microscopie à épifluorescence avec des filtres spécifiques pour la fluorescéine, la rhodamine et le DAPI. Pour chaque sonde chromosomique, 1000 noyaux spermatiques ont été analysés lorsque la concentration de spermatozoïdes le permettait.

Analyses statistiques

Un test non paramétrique de Kruskal-Wallis a été utilisé pour comparer les moyennes des concentrations, mobilité, morphologie des spermatozoïdes, des pourcentages de fragmentation de l'ADN et des pourcentages des anomalies chromosomiques entre le groupe des hommes porteurs de translocations et le groupe des hommes contrôles. Les différences étaient considérées comme significatives quand la valeur de la probabilité était inférieure à 0,05.

Résultats

Caractéristiques spermatiques

Dans le groupe des hommes porteurs de translocation, 3 hommes présentaient une oligozoospermie modérée et 8 hommes présentaient une oligozoospermie extrême. Tous les hommes présentaient une asthénozoospermie. Dix hommes présentaient une tératozoospermie. La concentration, la mobilité et la morphologie typique des spermatozoïdes sont significativement plus basses chez les hommes porteurs de translocation comparées à la population contrôle.

Apoptose dans les spermatozoïdes

Le pourcentage de fragmentation de l'ADN spermatique est significativement plus élevé chez les hommes porteurs de translocations comparé à la population contrôle (p = 0,0036).

Ségrégation méiotique

La proportion de spermatozoïdes déséquilibrés pour les chromosomes 13 et 14 est significativement plus importante chez les hommes porteurs de translocations (13;14) par rapport à la population contrôle (p=0,00016).

Discussion

Dans cette étude, la ségrégation méiotique des chromosomes 13 et 14 et l'apoptose ont été analysées dans une série de 12 translocations Robertsoniennes (13;14). Une ségrégation méiotique fiable des chromosomes est essentielle pour une reproduction normale. Des erreurs dans la ségrégation des chromosomes au cours des deux divisions méiotiques peuvent conduire à la perte des gamètes, à une hypofertilité ou à des anomalies chromosomiques dans la descendance.

L'étude de la ségrégation méiotique a montré une fréquence moyenne de 15 % de spermatozoïdes déséquilibrés pour les chromosomes 13 et 14. Cette fréquence observée est inférieure à la fréquence théorique attendue avec une prédominance de formes équilibrées suggérant une élimination des cellules germinales anormales.

Dans notre étude, nous avons observé une augmentation significative de l'apoptose dans les spermatozoïdes d'hommes porteurs de translocations Robertsoniennes (13;14) par rapport à la population contrôle. Nos résultats montrent une activation du processus apoptotique dans les testicules d'hommes porteurs de translocations Robertsoniennes (13;14). Ceci pourrait suggérer un rôle de l'apoptose pour éliminer les cellules germinales déséquilibrées. L'étude de l'apoptose dans les testicules de verrats porteurs d'une translocation chromosomique (X;14) a montré une atteinte prépondérante des spermatocytes (Koykul et al., 2000). Etant donné que l'appariement des chromosomes transloqués apparaît normal, les auteurs suggèrent que l'atteinte du processus méiotique serait due à l'invalidation par la translocation d'un gène impliqué dans l'apoptose (Koykul et al., 2000). Dans les souris mâles porteuses de translocations Robertsoniennes, Eaker et al. (2001) suggèrent que la malségrégation de la translocation soit responsable d'un mauvais alignement des chromosomes au niveau du fuseau métaphasique activant ainsi un mécanisme de contrôle déclenchant l'apoptose. Récemment, Modi et al. (2003) ont observé une augmentation de l'apoptose des cellules germinales par la technique TUNEL dans les gonades fœtales humaines avec aneuploidies des chromosomes sexuels.

D'autres types de translocations Robertsoniennes sont nécessaires à étudier. En effet, bien que les chromosomes soient différents, la ségrégation méiotique des chromosomes se fait à partir d'un trivalent. Ainsi, les résultats obtenus pourraient permettre de relier l'apoptose à la figure méiotique ou aux chromosomes impliqués dans la translocation. L'identification des mécanismes génétiques par lesquels les cellules germinales contenant des anomalies chromosomiques sont éliminées par le processus apoptotique pourrait aider à la prévention de la transmission d'anomalies chromosomiques à la descendance.

Bibliographie

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