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Titre: Diagnostic génétique pré et post-implantatoire
Année: 2000
Auteurs: - Benkhalifa M.
Spécialité: Infertilité
Theme: DPI

 Diagnostic génétique pré et post-implantatoire par hybridation in situ multifluorescente et PCR multiplexe : 
indications et troubles shooting. 

M, Ben Khalifa (1,3) ; N, Frydman (1), G Tachdjian (1) ; F, Olivennes (2) ; SB, Melancon (3) ; P, Miron (3) ; R, Frydmann (2) ; S, Hamamah (1). Laboratoire de Biologie de la Reproduction et de Cytogénétique (1) et Département de Gynécologie Obstétrique (2). Hôpital Antoine Béclère. 92140 Clamart France. PROCREA BioSciences, Genetics &IVF; unit (3). 1100 avenue Beaumont, bureau 305, Ville Mont Royal Québec H3P3H5. Canada. 

Mots clés : fécondation in vitro, diagnostic, maladies chromosomiques et géniques.

Introduction 

Le diagnostic génétique pré-implantatoire (DPI) s’est développé grâce au développement de la procréation médicalement assistée et de la génétique de la reproduction. 

Le DPI repose sur l’analyse du contenu génétique du gamète ou d’embryons obtenus par fécondation in vitro. 

L’avantage majeur du DPI est de pouvoir proposer à un couple qui présente un risque élevé de transmettre à la fratrie une maladie chromosomique ou génique de transférer et/ou de congeler des gamètes ou des embryons non atteints.

 Depuis les premières tentatives de biopsie embryonnaire et d’obtention de grossesse ( Handyside et al, 1990), on compte aujourd’hui plus de 50 centres de DPI répartis dans 22 pays et qui ont réalisé autour de 2000 cycles cliniques avec 500 grossesses et 300 naissances (Verlinsky et al, 1999). 

Pour un couple fertile, les principales indications cliniques du DPI sont les anomalies génétiques autosomiques récessives ou dominantes, les maladies liées au sexe et les anomalies chromosomiques constitutionnelles ( Lieabars et Ben Khalifa 1999). 

Au stade post-implantatoire, le diagnostic prénatal (DPN) des anomalies chromosomiques et des aberrations géniques présente une source d’inquiétude et de stress pour la future maman et pour la famille en général. D’après Finly et al (1977), 86% des femmes subissant un DPN redoutent la révélation d’une anomalie et 83% manifestent une anxiété durant la période d’attente des résultats qui peut durer de 2 à 3 semaines. Pour ces raisons, une annonce rapide d’un screening ou d’un diagnostic préliminaire peut réduire l’anxiété, le risque d’affecter le développement fœtal et permet d’améliorer l’attachement mère-enfant à l’annonce d’un résultat normal. 

La pratique du dépistage prénatal biochimique au premier trimestre par dosage de la PAPP-A et de la (-hCG libre en combinaison avec la mesure de la clarté nucale ouvre une nouvelle voie en diagnostic prénatal, car la combinaison de la biochimie et de l’échographie peut détecter jusqu’à 90 % des trisomies 21, ainsi que la trisomie 18 et les encéphalites. À l’annonce d’un dépistage positif, le lavage transcervical (Sherlock et al 1997), la biopsie de villosités choriales ou l’amniocentèse précoce avec filtration (Sundberg et al 1995) peuvent fournir du matériel fœtal pour des analyses chromosomiques ou géniques. 

Les techniques d’hybridation in situ et/ou de PCR quantitative fluorescente (Adinolfi et al 1995) ne nécessitent pas une culture cellulaire pour l’identification sous 24-48 heures des aberrations numériques, de mosaïcisme pour les chromosomes 13, 18, 21, X et Y et qui représentent plus de 90 % des aberrations chromosomiques détectées en diagnostic prénatal (Ben Khalifa et al 1999 ).

MATÉRIELS ET MÉTHODES. 

Diagnostic pré-implantatoire pré-zygotique 

L’analyse chromosomique au stade métaphasique du spermatozoïde nécessite une fécondation hétéro-spécifique homme/hamster. Cette technique est assez longue et l’on arrive à bloquer que 10-15% des ovocytes fécondés au stade de métaphase après blocage à la colchicine. Néanmoins, cette méthode reste utile pour l’analyse de ségrégation des remaniements complexes dans le sperme. Pour le screening des aneuploïdies et du mosaïcisme, l’hybridation in situ fluorescente est un outil rapide et efficace pour estimer la disjonction d’un ou plusieurs chromosomes (Ben Khalifa et al 1994) ou le comportement d’une anomalie d’un éjaculat à l’autre et/ou dans différents foyers de spermatogenèse dans les testicules. Pour des patients qui présentent un spermogramme perturbé ou une oligospermie complète avec une LH normale et FSH élevée, on pratique une PCR multiplexe pour 19 marqueurs sur le chromosome Y; parmi ces 19 marqueurs, 16 couvrent les régions AZFa, b, c, d. Ces méthodes d’analyse du gamète mâle peuvent nous aider sur le choix d’éjaculat et la pratique d’une FIV ou d’ICSI. L’analyse d’ovocytes non clivés après tentative de fécondation in vitro peut nous éclairer sur le degré de maturité cytoplasmique et le pouvoir fécondant des spermatozoïdes (Ben Khalifa et al 1996). 

Pour des indications bien spécifiques, la biopsie du premier et du deuxième globule polaire à l’aide d’un système LAZER (Fertilaze) et l’hybridation in situ multifluorescente peuvent être une alternative à la biopsie du blastomère et ne posent pas le problème du mosaïcisme au stade embryonnaire précoce et de contamination par l’ADN du spermatozoïde. 

Mais en diagnostic de routine, l’analyse du spermatozoïde, des globules polaires ou de l’ovocyte nous renseigne uniquement sur la contribution paternelle ou maternelle à la genèse de l’embryon anormal. 

Diagnostic pré-implantatoire post-zygotique 

Pour l’étude des anomalies chromosomiques, la biopsie peut être pratiquée au stade embryonnaire précoce ou au stade de blastocyste. Après biopsie, les blastomères sont transférés dans une solution de choc hypotonique puis traités à l’acide citrique avant d'être fixés avec un mélange de méthanol/acide acétique (2/1, v/v). Différentes sondes chromosomiques disponibles dans le commerce et directement marquées avec plusieurs fluorochromes (Vysis) peuvent être utilisées pour les techniques d’hybridation in situ fluorescente. L’analyse par FISH est réalisée suivant le protocole décrit par le fabricant avec quelques modifications. La température d'hybridation est portée à 42°C pendant 30 min pour les sondes centromériques et à 37°C pendant 2 heures pour les sondes spécifiques. Les lavages de post-hybridation sont effectués dans 0,4xSSC, 0,3% NP40, 2 min à 73°C, puis 1 min dans 2xSSC, 0,1% NP40 à température ambiante. Après une déshydratation dans une série de bains d'éthanol (70%, 80%, 90% et 100%), les chromosomes sont contre-colorés par du 4’6’ diamino-2 phenylindole (DAPI) et observés par microscopie fluorescente. L’analyse d’un locus ou d’un gène par biologie moléculaire nécessite une lyse des blastomères biopsiés, pour permettre à la polymérase l’amplification de l’ADN. La biopsie au stade précoce nécessite une amplification génomique totale par DOP ou PEP PCR avant l’amplification du gène spécifique. Pour la DOP PCR, on prélève les blastomères dans 10 - 15 µl d’eau stérile, on pratique une thermolyse à 95°C pendant 5 min et on conserve le tube à -20°C pour libérer l’ADN. L'amorce aléatoire de la DOP-PCR [5' CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G 3' (N = A, C, G, or T)] est utilisée pour amplifier l'ADN génomique. La réaction de PCR est réalisée dans le mélange suivant : 2 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris HCl, pH 8,4, 0,1 mg/ml de gélatine, 200µM de chaque dNTP, 2µM d'amorces aléatoires et 1.25U de Taq polymérase dans un volume de 50 µl. L'amplification est effectuée dans un appareil à PCR et selon le programme de cycle suivant: 10 min à 93°C, suivie de 5 cycles de 1min à 94°C, 1,5 min à 30°C, 3 min de transition 30-72°C, et 3 min extension à 72°C. Ces cycles précèdent 35 d'autres de 1 min à 94°C, 1 min à 62°C, et 3 min à 72°C chacun. Une étape d'extension finale de 10 min à 72°C est effectuée. Pour la PEP PCR, les blastomères sont prélevés dans 10 µl d’eau stérile, une thermolyse à 95°C 5 min est réalisée. Après une dénaturation à 95°C pendant 15 min, 20 µl du mélange de PCR (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 25 mM ; dNTPs: 100 µM de chaque, 35 µM d’amorces aléatoires à 15 nucléotides) et 1 µl de Taq polymérase sont ajoutés. Les différentes étapes d’amplification comprennent 10 min de dénaturation à 94°C, 50 cycles de 2 min à 37°C, transition de 37 à 55°C, 4 min d'extension à 55°C et une étape d'extension finale de 10 min à 72°C. Les produits d’amplification sont analysés par une électrophorèse sur un gel d'agarose de 1% et visualisés par du bromure d’éthidium. Les produits de PEP ou de DOP-PCR peuvent être conservés à +4°C pendant 2 mois avant des amplifications spécifiques ultérieures. En effet, après validation de la DOP ou de la PEP-PCR, un gène spécifique peut être amplifié à partir du produit DOP ou PEP-PCR en utilisant un contrôle interne d'amplification. La procédure de PCR est variable d’un diagnostic à l'autre. Une restriction enzymatique et une électrophorèse peuvent être réalisées après PCR pour l’analyse du produit d’amplification, sinon un séquençage direct. 

Diagnostic post-natal rapide par hybridation in situ 

Cette technique peut être proposée aux femmes qui ont un risque élevé d’avoir un enfant atteint de trisomies 13, 18 et 21 ou d’anomalies liées aux chromosomes sexuels. Ce risque peut être fondé sur des indications qui peuvent être révélatrices d’anomalies chromosomiques majeures telles que : (1) l’âge maternel > 38 ans à la date du prélèvement, (2) des signes d’appel échographiques, (3) les grossesses estimées à risque après un dépistage prénatal biochimique, (4) un âge gestationnel tardif. Les cellules non cultivées provenant de biopsies de villosités choriales, de ponctions de liquide amniotique ou de sang de cordon sont traitées par deux enzymes, la trypsine EDTA et la collagénase, avant choc hypotonique au Kcl ou au tri-natrium citrate. L’ADN des cellules en interphase est fixé sur des lames en verre puis dénaturé afin de lui donner sa forme mono caténaire. Pour cet examen de routine, on utilise une trousse de sondes géniques AneuVysion de la société Vysis (A.D.M n° : R58982). L’hybridation est réalisée avec des sondes spécifiques pour les chromosomes 13, 18, 21, X et Y. Après hybridation, lavage et contre-coloration, les lames sont examinées en utilisant un microscope à fluorescence équipé de filtres spécifiques des fluorochromes de marquage des sondes ADN. Pour chacun des cinq chromosomes étudiés, on analyse en moyenne 100 cellules. L’échantillon est considéré normal lorsqu’au moins 80 % des noyaux observés présentent un nombre normal de signaux. L’échantillon est considéré anormal si 60 % des cellules montrent la même anomalie. Le cas où une anomalie est retrouvée dans plus de 10 % mais moins de 60% des cellules analysées n’est pas concluant ; la recherche d’une mosaïque éventuelle est poursuivie grâce à l’analyse de 200 noyaux supplémentaires. Un résultat négatif permet de rassurer le médecin et les parents concernant la très large majorité des anomalies chromosomiques mais il est nécessaire de rendre le caryotype fœtal pour diagnostiquer d’autres anomalies de nombre et de structure. Un résultat positif indique que le fœtus est porteur d’une anomalie numérique pour un ou plusieurs des cinq chromosomes étudiés. En fonction de l’anomalie chromosomique, la patiente et son médecin peuvent discuter et planifier la conduite à suivre pour l’intérêt du fœtus et de sa maman. Entre-temps, le caryotype viendra confirmer le diagnostic et le compléter. 

RÉSULTATS ET DISCUSSION 

L'application du DPI en clinique évolue lentement car il s'agit d'une procédure complexe aussi bien au niveau du laboratoire qu'au niveau clinique. Au niveau du laboratoire, en dehors de l'étude du sexe et de la recherche d'aneuploïdie chromosomique par FISH, il faut mettre au point ou réévaluer les techniques de biologie moléculaire (PCR, amplification, restriction enzymatique et autres méthodes d'analyse) permettant la détection d'une mutation au niveau d'une cellule de façon fiable et efficace. Chaque demande de DPI est spécifique pour un couple et une pathologie donnée. Au niveau clinique, les couples souvent fertiles doivent subir une FIV afin de pouvoir répondre à leur désir d'enfants non atteints de maladies génétiques graves. L’hybridation in situ multifluorescente en marquage direct avec contrôle interne est un outil rapide et efficace pour l’étude du sexe et des aneuploïdies chromosomiques. Néanmoins, il faut tenir compte des problèmes d'hybridation et de spécificité. Au stade pré-zygotique, la FISH sur ovocyte ou globule polaire ne permet pas de mettre en évidence la contribution paternelle. La biopsie embryonnaire précoce permet de connaître la contribution à la fois maternelle et paternelle. Cependant le risque d’une contamination par l’ADN du spermatozoïde est important dans le cadre d’une FIV classique. De plus, l’analyse du mosaïcisme chromosomique ne peut être réalisée par défaut de matériel. La biopsie précoce effectuée par micromanipulation peut être remplacée par une autre plus précise à savoir, la biopsie du blastocyste par laser (Veiga et al, 1997) et avoir plus de matériel pour l’étude. La biopsie du blastocyste permet de surmonter la limite de la biopsie et donne la possibilité d’un éventuel contrôle de la FISH ou de la PCR (Muggleton Harris et al 1995, Ben Khalifa et al 1997). pour les maladies génétiques, l’amplification de l’ADN après biopsie peut être un facteur limitant pour l’analyse d’un gène, d’où l'intérêt d’une amplification génomique totale par PEP ou par DOP-PCR avant l’amplification spécifique et l’étude d’un gène donné. Au-delà des échecs d’amplification de l’ADN d’un seul blastomère, la PCR présente d’autres inconvénients à savoir le risque de contamination élevé et l’adaptation du protocole de PCR à chaque maladie analysée par DPI. En diagnostic prénatal (DPN), l’identification des aneuploïdies des chromosomes 13, 18, 21, X et Y par hybridation in situ est une procédure fiable et rapide. Son application sur des cellules non cultivées peut détecter les 2/3 des anomalies chromosomiques après amniocentèse. Cette technique est pratique pour des cas urgents en attente d’une décision médicale ou dans le cas d’une grande anxiété maternelle qui risque d’affecter le développement fœtal. Cet examen détecte uniquement les désordres numériques des cinq chromosomes étudiés en sachant que ces derniers représentent la majorité des aberrations diagnostiquées en cytogénétique prénatale. Ce test ne permet ni la détection des anomalies numériques touchant le reste des chromosomes, ni les anomalies de structure (Ben Khalifa et al 1999). L’hybridation in situ rapide n’est pas une alternative au caryotype classique mais elle présente un outil de diagnostic précoce pour les patientes à haut risque d’aneuploïdies majeures. La question de spécificité se pose pour les prélèvements contaminés avec les cellules maternelles et les échantillons qui présentent un faible mosaïcisme. Dans ces cas, l’analyse du caryotype avant 8 jours est utile pour confirmer ou/et compléter la FISH. D’après la littérature, la majorité des techniques de cytogénétique classique ont confirmé les résultats de l’hybridation in situ avec un pourcentage de faux positifs et de faux négatifs très faible. L’hybridation in situ rapide est un outil performant pour les grossesses à haut risque d’aneuploïdies majeures. Le caryotype conventionnel viendra compléter le diagnostic pour le reste des aberrations du génome. Des nouvelles techniques telles que l’hybridation génomique comparative (Kallioniemi et al, 1992), la PCR quantitative (Von Eggeling et al, 1993), le gène dosage par PCR fluorescente (Findlay et al, 1995a; b) ou la puce à ADN (Jonathan et al, 1999), restent à adapter en DPI et en DPN précoce. Malgré les avantages du DPI, une possibilité de diagnostic prénatal est toujours possible. Pour le DPI, il faut identifier clairement les indications, le risque d’une stimulation ovarienne, les chances de réussite pour un choix de DPI versus DPN. 


REFERENCES

Adinolfi M, Sherlock J, Perti B (1995). Rapid detection of selected aneuploidies by quantitative fluorescent PCR. BioEssays v17 n°7 : 661-6565

BenKhalifa M, Malet P, Tair N, Boucher D, Menezo Y (1994).Chromosomes aberrations in normal and translocated sperm: Role in reproduction failure. Ref Gyn Obs V2 n° 3 288-296.

BenKhalifa M, Menezo Y, Janny L, Pouly JL, Quimsiyeh M (1996). Cytogenetiocs of Uncleaved Oocytes and Arrested Zygotes In IVF Programs. Jou. Assist Reprod Genet 1996 V13 N2, 140-148

BenKhalifa M, Veiga A, Sandalinas M, Qumsiyeh M, Ménézo Y: Co-culture, blastocyst biopsy and molecular techniques applications in preimplantation diagnosis.Second international symposium on preimplantation genetics , Chicago, september 1997.

BenKhalifa M, Mercier S, Tachdjian G, Baldi M (1999). Diagnostic des aneuploïdies chromosomiques majeures en diagnostic prénatal sous 24-48 heures. Sous presse Regards Gyn-Obs

Findlay I, Ray P, Quirke P, Rutherford A and Lilford R, (1995a): Allelic drop-out and preferential amplification in single cells and human blastomeres: Implication for preimplantation diagnosis of sex and cystic fibrosis. Mol Hum Reprod, 10(6), 1609-1618

Findlay I, Urquhart A, Quirke P, Sullivan K, Rutherford JA, Lilford RJ, (1995b): Simultaneous DNA fingerprinting diagnosis of sex and single-gene defect status from single cells. Hum Reprod, 10(4), 1005-1013

Handyside AK, Kontogiani EH, Hardy K and Winston RML (1990). Pregnancies fom biopsied human préimplantation embryos sexed by Y specific DNA amplification. Nature, 344, 768-770

Liebaers and BenKhalifa (1999). Diagnostic génétique pré-implantatoire : indications, techniques et résultats. Editions Ellipses : ISBN2-7298-4810X. 1999, 1346-354.

Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Sudar D, Rutovitz D, Gray JW, Waldman F, and Pinkel D (1992): Comparative genomic hybridization for molecular cytogeneic analysis of solid tumors Science, 1992, 258, 818-821

Jonathan R, Perou C, Alizadeh A Eisen M et al (1999) ; Genome wide analysis of DNA copy number changes using cDNA microarrays . nature genetics V23 : 41-46

Muggleton Harris L, Glazier AM, et al (1995): Genetic diagnosis using polymerase chain reaction and fluorescent in situ hybridation analysis of biopsied cells from both the cleavage and blastocyst stage of individual cultured human preimplantation embryos; Hum Reprod 10, 1, 192-195

Sherlock J, Halder A, Tutshek B, Delhanty, Rodeck C, Adinolfi M (1997). Prenatal detection of fetal aneuploidies using transcervical cell samples. J Med Genet 34. 302-305

Veiga A, Sandalinas M, Benkhalifa M, Boada M, Santalo J, Barri PN and Menezo Y (1997): Laser blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis in the human. Zygote in press

Verlinsky Y and Kuliev A (1999). Preimplantation genetics diagnosis.
Reprod Med Review. 7 :1-10

Von Eggeling F, Freytag M, Fashold R, Horsthemke B, Claussen U, (1993): Rapid detection of trisomy 21 by quantitative PCR. Hum Genet 1, 567-570