Service de Biologie et de Génétique de la Reproduction
Hôpital Antoine Béclère
157, rue de la Porte de Trivaux
92140 Clamart

Introduction

Les déséquilibres chromosomiques sont chez l’homme la cause principale des anomalies de la reproduction (avortements précoces et stérilités), des malformations congénitales et des retards mentaux (Hook, 1985). Ces anomalies chromosomiques peuvent correspondre soit à des aneuploïdies, soit à des anomalies de structure chromosomique. Ces aberrations ont un risque de survenue élevé lorsqu’elles sont liées à la présence d’une anomalie chromosomique de structure équilibrée présente chez l’un des membres du couple ou si l’âge maternel est élevé. Leur diagnostic est classiquement réalisé grâce à l’établissement du caryotype en bandes qui nécessite l’obtention préalable de divisions cellulaires. Depuis une dizaine d’années le développement de l’hybridation in situ fluorescente (FISH) permet le diagnostic de déséquilibres chromosomiques dans les noyaux des cellules en interphase. L’application de cette technique pour détecter des déséquilibres chromosomiques dans des blastomères ou des globules polaires permet de réaliser un diagnostic préimplantatoire (DPI) de déséquilibres chromosomiques constitutionnels hérités ou liés à l’âge maternel (Harper et Wells, 1999 ; Harper et Delanthy, 2000).

Principe du diagnostic preimplantaToire cytogénétique

Le DPI cytogénétique nécessite une fécondation in vitro (FIV) suivie d'une biopsie d'un ou deux blastomères. La biopsie des blastomères est classiquement réalisée au troisième jour de culture de l’embryon.
Pour des indications bien spécifiques, la biopsie du globule polaire (diagnostic pré-conceptionnel) peut être une alternative à la biopsie du blastomère. Cependant cette analyse des globules polaires ne renseigne que sur la contribution maternelle.
Le principe de l’hybridation in situ fluorescente repose sur l'hybridation d’un fragment d’ADN (sonde), spécifique d’une région chromosomique et marqué par des nucléotides couplés à un fluorochrome, sur l'ADN de chromosomes interphasiques préalablement dénaturé. Après hybridation, en général de quelques heures (2 à 16 heures), la sonde est visualisée par le signal émis par le fluorochrome excité par un faisceau lumineux monochromatique d’un microscope à épifluorescence. La sonde apparaît alors sous forme d'un signal fluorescent dont la couleur dépend du fluorochrome utilisé. En co-hybridant des sondes marquées avec des fluorochromes différents, il est possible, grâce à l'utilisation de filtres spécifiques pour chacun des fluorochromes, d’étudier simultanément différentes régions chromosomiques (Pergament, 2000).
En choisissant des sondes en fonction du déséquilibre chromosomique recherché on peut ainsi établir un diagnostic préimplantatoire d’anomalies chromosomiques.

Le diagnostic de sexe:
La détermination du sexe par FISH est réalisée chez des couples à risque de transmettre une anomalie génique liée au chromosome X et qui ne peut être identifiée par les techniques de biologie moléculaire. Le sexe chromosomique des embryons est déterminé par FISH sur blastomère en utilisant des sondes spécifiques des chromosomes X et Y. En cas de maladie récessive liée au chromosome X, seuls les embryons féminins pourront être transférés in utero.

Les diagnostics de translocations :
Deux types de translocations peuvent être étudiés dans le cadre du DPI. Il s'agit des translocations Robertsoniennes et des translocations réciproques.
Les translocations Robertsoniennes correspondent à la fusion centromérique de deux chromosomes acrocentriques (chromosomes 13, 14, 15, 21 et 22). L'individu porteur d'une translocation Robertsonienne peut avoir une ségrégation méiotique déséquilibrée des chromosomes impliqués dans la translocation. Ce déséquilibre chromosomique sera à l'origine d'un embryon trisomique ou monosomique pour l'un des chromosomes impliqués dans le remaniement.
Les translocations réciproques sont des échanges de segment chromosomique entre deux chromosomes. L'individu porteur d'une translocation réciproque peut avoir une ségrégation méiotique déséquilibrée des chromosomes impliqués dans la translocation. Les déséquilibres chromosomiques possibles seront à l'origine lors de la fécondation d'embryons avec des altérations quantitatives de matériel génétique correspondant à des trisomies partielles et des monosomies partielles des chromosomes transloqués. L'évolution de ces embryons se traduira soit par des fausses couches spontanées ou des anomalies du développement embryo-fœtal.
L’existence chez l’un des membres d’un couple d’une translocation Robertsonienne ou réciproque équilibrée est donc une situation à risque de survenue de déséquilibre chromosomique partiel ou complet. Ce risque est fonction de la localisation des points de cassure et de ce fait est caractéristique de chaque translocation (Jalbert et al., 1980). En dehors du cas exceptionnel de la translocation (11;22), il n’existe pas en pathologie constitutionnelle de translocation réciproque récurrente. Ainsi, chaque couple porteur d’une translocation réciproque constitue un cas singulier pour lequel les risques de survenue dans la descendance de déséquilibre partiel doivent être établis de façon spécifique (Cohen et al., 1992). Ainsi en fonction de l’histoire familiale (antécédents de fausse couches à répétition, d’enfants porteurs de malformations, de stérilité, de diagnostics prénataux avec interruption médicale de grossesse) et du risque de récidive inhérent à la translocation, un diagnostic cytogénétique préimplantatoire peut être proposé.

PROTOCOLE TECHNIQUE

Sondes utilisées :
Les sondes sont des fragments d’ADN spécifiques de régions chromosomiques.
L’établissement du sexe chromosomique embryonnaire utilise des sondes spécifiques des chromosomes X et Y marquées avec des fluorochromes différents.
Pour l’étude des translocations Robertsoniennes, les sondes utilisées sont spécifiques des bras longs des chromosomes acrocentriques.
Pour l’étude des translocations réciproques, trois sondes sont utilisées : deux sondes distales par rapport aux points de cassure des deux chromosomes impliqués et la troisième sonde proximale par rapport au point de cassure d’un seul des chromosomes (Scriven et al., 1998). Ces sondes sont générées à partir de séquences spécifiques des régions télomériques des chromosomes (Knight et al., 2000).

Etalement et fixation des blastomères :
L’étude des anomalies chromosomiques nécessite la fixation du blastomère sur un support solide avant de pratiquer l’hybridation in situ.
Les blastomères biopsiés sont donc étalés sur une lame de verre. Le cytoplasme est digéré par mise en contact, sous contrôle microscopique, avec une solution de 0,01N HCl/Tween 20 permettant d’obtenir le noyau du blastomère sans cytoplasme. Cette étape de digestion permet ensuite une bonne accessibilité de la sonde à l’ADN du noyau du blastomère.
Les lames sont ensuite plongées dans une série de solutions permettant la digestion complète des débris cytoplasmiques et la fixation du noyau.

Hybridation in situ sur blastomères :
Après la fixation des blastomères, les sondes chromosomiques sont déposées sur la lame et recouvertes d’une lamelle scellée avec du rubber cement. La lame est déposée sur une plaque chauffante à 75°C entre 3 à 5 minutes pour permettre la dénaturation simultanée de l’ADN nucléaire et des sondes. La lame est ensuite mise à 37°C durant 3 à 5 heures pour les sondes centromériques de l’X et de l’Y et 16 heures pour les sondes télomériques.

Analyse microscopique :
Après une série de lavages de post-hybridation, les signaux d'hybridation sont observés en utilisant un microscope à épifluorescence muni de filtres spécifiques des longueurs d’onde d’excitation et d’émission des fluorochromes incorporés dans les sondes. En fonction du nombre de signaux fluorescents observés pour chaque région chromosomique, un diagnostic est établi pour chaque embryon.
L’hybridation in situ multi-fluorescente en marquage direct est un outil rapide et efficace pour l’étude du sexe et des aneuploïdies chromosomiques. Il faut cependant tenir compte des problèmes d'hybridation et de spécificité.
D’autre part, au stade pré-zygotique, la FISH sur globule polaire ne permet pas d’étudier la contribution paternelle. La biopsie embryonnaire permet de connaître la contribution à la fois maternelle et paternelle.
Le risque d’une contamination par l’ADN du spermatozoïde est important dans le cadre d’une FIV classique. Ainsi, l’ICSI doit être utilisée de façon systématique pour la fécondation des ovocytes dans le protocole de DPI.
L’analyse cytogénétique à partir d’un blastomère ne permet pas d’éliminer un éventuel mosaïcisme chromosomique.

En conclusion, des nouvelles techniques telles que l’hybridation génomique comparative (Lapierre et al., 2000), la puce à ADN (Jonathan et al., 1999), la conversion d’un noyau interphasique en métaphase (Evsikov et Verlinsky 1999), le recyclage de l’ADN et l’hybridation séquentielle (Bahce et al., 2000), restent à adapter en routine pour le diagnostic cytogénétique préimplantatoire.