Diagnóstico Genético preimplantatorio en Aborto recurrente:
implicaciones de las anomalías cromosómicas en embriones y espermatozoides.

1Amparo Ruiz, 1Carmen Rubio, 1,2José Remohí, 1,2Carlos Simón, 1,2,3Antonio Pellicer.

1Instituto Valenciano de Infertilidad; 2Dept. Obstetricia y Ginecología, Universidad de Valencia; 3Hospital Universitario Dr. Peset, Valencia, España.

Introducción

El aborto recurrente (AR) se define como tres ó más pérdidas gestacionales consecutivas, aunque la tendencia actual es considerarlo como dos ó más abortos (1).
Ésta es una afectación compleja en la que, los numerosos estudios llevados a cabo, han aportado escasa información respecto de la etiología, prevención y tratamiento de este fallo reproductivo (2).
El scrrening de rutina, incluye exproraciones endocrinilógicas, inmunológicas, ecográficas, y microbiolólicas orientadas a evaluar los factores de riesgo, así como cariotipo parental.
Aun despues de todos estos estudios, casi el 50% de los casos siguen clasificados como de etiología desconocida (2, 3, 4).
Es bien conocido por otra parte, que existen alteraciones cromosómicas implicadas en el aborto espontáneo del primer trimestre con una incidencia que oscila entre el 50-70% en estudios fetales (5,6,7,8) y el 83% en muestras de vellosidades coriales (9).
Las causas más comunes de aborto espontáneo son las anomalías numéricas no hereditarias (con cariotipo parental normal) que aparecen de novo, siendo las más comunes las trisomías autosómicas (75.9%) seguidas por las monosomías X (11.4%), triploidías (6.3%) y tetraploidías (3.8%). Solo en el 4.7% de las parejas con 2 ó más abortos uno de los padres es portador de una anomalía estructural equilibrada (10).
Por otra parte, el hecho de que la donación de ovocitos haya sido aplicada por algunos grupos como tratamiento efectivo para estas pacientes, apoya la idea de que en algunos casos, el origen de los abortos puede estar relacionado con factores ovocitarios (11).
Basándonos en estas evidencias, nos planteamos la hipótesis de que las anomalías cromosómicas que aparecen de novo, por errores aleatorios producidos durante la gametogénesis y el desarrollo embrionario, pueden ser un importante factor etiológico en pacientes con AR.
Diseñamos un primer estudio para averiguar la incidencia real de anomalías cromosómicas en los embriones de pacientes con AR para transferir los embriones normales y evitar el aborto y un segundo estudio para evaluar la contribución del espermatozoide al AR, a nivel cromosómico.
Para ello realizamos diagnóstico genético preimplantatorio (DGP) en AR analizando anomalías cromosómicas en embriones mediante hibridación in situ fluorescente (FISH). Esta misma técnica fue empleada para obtener las tasas de espermatozoides disómicos y diploides.

DGP en embriones de parejas con AR.

El grupo de estudio lo constituyeron 16 parejas con edad materna inferior a 37 años y al menos 3 abortos previos de causa desconocida, que llevaron a cabo 19 ciclos de DGP. En los embriones de las parejas afectadas, se hizo FISH para los cromosomas más frecuentemente implicados en el aborto espontáneo: 13, 16, 18, 21, 22, X and Y. Los resultados obtenidos se compararon con los de un grupo control constituido por 10 parejas a las que se realizó DGP por enfermedad ligada al sexo, cuyas características epidemiológicas eran similares a las del grupo de estudio.
Tras un ciclo de fecundación in vitro con microinyección espermática (ICSI), se realizó la biopsia embrionaria en el día 3º de desarrollo en estadio de 8 células, lo que nos permite extraer una o dos blastómeras sin que se afecte el desarrollo embrionario. Tras la biopsia los embriones fueron cultivados hasta día 5, mientras se llevaba a cabo en análisis de los núcleos fijados de las blastómeras extraídas.
El 66.2 % de los embriones analizados en el grupo de AR resultaron anormales para alguno de los cromosomas estudiados, mostrando diferencia estadísticamente significativa con el grupo control (25.5%). De las gestaciones obtenidas en el grupo de AR una terminó en aborto y el cariotipo fetal fue 46,XY. También en el grupo control se registró un aborto.
Es importante constatar que en el 25 % de los ciclos, todos los embriones fueron anormales y no se hizo transferencia.
En conclusión, este primer estudio demostró un aumento de la incidencia de anomalías cromosómicas en pacientes con AR (66.2%) comparadas con las del grupo control (25.5%), así como una elevada incidencia de pacientes con todos sus embriones anormales. Además se consiguió una elevada tasa de gestación a término al seleccionar los embriones cromosómicamente normales para la transferencia. Estos resultados confirman que el estatus cromosómico de los embriones de parejas con AR es peor que el de las pacientes no abortadoras a las que se realiza FIV y puede clarificar numerosos casos de AR inexplicado.

Estudio de disomía y diploidía en espermatozoides.

Para estudiar las anomalías cromosómicas en espermatozoides de parejas con AR, hicimos FISH para los cromosomas 13, 18, 21, X e Y en el núcleo descondensado de los espermatozoides.
En este estudio (12), incluimos 12 parejas con cariotipo normal y con, al menos 2 abortos previos de causa inexplicada. Estas parejas fueron divididas en 2 grupos: El grupo I incluyó 5 pacientes con respuesta ovárica normal y con parámetros seminales normales o con movilidad "borderline"; el grupo II, estaba constituído por 7 parejas a las que se practicó donación de ovocitos por baja respuesta a las gonadotrofinas. Y las muestras seminales mostraban oligoastenozoospermia o astenozoospermia. En el grupo control fueron analizadas 14 muestras de donantes normozoospérmicos.
Todas las muestras de semen fueron analizadas por FISH para los cromosomas anteriormente mencionados.
La incidencia de disomías de cromosomas sexuales (0.84%) fue significativamente mayor que la del grupo control (p<0.0001), mientras que los porcentajes de disomías y diploidías autosómicas no alcanzaron diferencias estadísticamente significativas.
En el grupo de pacientes tratadas con sus propios ovocitos solo hubo diferencias (p=0.01) en las disomías de los cromosomas sexuales, con un porcentaje del 0.60%. Sin embargo, en el grupo de donación de ovocitos, la frecuencia de disomías sexuales fue de 1.00% y la tasa media de espermatozoides diploides, de 0.43% mostrando de nuevo diferencias significativas (p=0.0008). En el grupo de donación de ovocitos se observó mayor incidencia de disomías sexuales (p=0.046) y de diploidías (p<0.0001) que en el grupo de FIV con ovocitos propios. Estos resultados son especialmente interesantes ya que en el grupo de donación ovocitaria el factor femenino está teóricamente descartado y por tanto el espermatozoide fue analizado como un factor de riesgo aisladamente.
Tras este segundo estudio pudimos concluir que existe mayor incidencia de disomías de los cromosomas sexuales en las muestras de semen de parejas con AR y también de diploidías en el caso de donación de ovocitos. Estos hallazgos sugieren una implicación de las anomalías cromosómicas de los espermatozoides en algunos casos de AR de causa desconocida, siendo de utilidad el FISH de espermatozoides en la evaluación de esta patología.
De todos los resultados obtenidos podemos concluir que, tanto el DGP en embriones preimplantatorios como el FISH de espermatozoides, aportan una valiosa información en muchos casos de AR de causa desconocida ya que, además de incrementar las posibilidades de gestación a término en estas parejas, orientarán la estrategia terapéutica más adecuada en cada caso dependiendo del tipo de anomalías encontradas y de si éstas son achacables a los espermatozoides o a los ovocitos.

Referencias

1. Stirrat GM. Recurrent miscarriage I: definition and epidemiology., causes and management. Lancet, 1990; 336:673-675.
2. Tho P, Byrd JR, McDonough PG. Etiologies and subsequent reproductive performance of 100 couples with recurrent abortion. Fertil Steril, 1979; 32: 389- 95.
3. Coulam C. Unexplained recurrent pregnancy loss. Clin Obstet Gynecol, 1986; 29:999-1004.
4. Clifford K, Rai R, Watson H, Regan L. An informative protocol for the investigation of recurrent miscarriage: Preliminary experience of 500 consecutive cases. Hum Reprod, 1994; 9: 1328- 32.
5. Boué J, Boué A, Lazar P. Retrospective and prospective epidemiological studies of 1500 karyotyped spontaneous human abortions. Teratology, 1975;12:11.
6. Hassold TJ, Matsuyama A, Newlands IM, et al. A cytogenetic study of abortions in Hawaii. Ann Hum Genet, 1978; 41: 443-54.
7. Plachot M. Chromosome analysis of spontaneous abortions after IVF. A European survey. Hum Reprod, 1989; 4: 425-429.
8. Eiben B, Bartels I, Bahr-Porch S, et al. Cytogenetic analysis of 750 spontaneous abortions with the direct preparation method of chorionic villi and its implications for studying genetic causes of pregnancy wastage. Am J Hum Genet, 1990; 47: 656-63.
9. Strom CM, Ginsberg N, Applebaum M, et al. Analysis of first-trimester spontaneous abortions by chorionic villus sampling and karyotype. J Assist Reprod Genet, 1992; 9: 458-61.
10. De Braekeleer M, Dao TN. Cytogenetic studies in couples experiencing repeated pregnancy losses. Hum Reprod, 1990; 5: 519-28.
11. Remohí J, Gallardo E, Levy M, et al. Oocyte donation in women with recurrent pregnancy loss. Hum Reprod, 1996; 11: 2048-2051.
12. Rubio C, Simón C, Blanco J, et al. Implications of sperm chromosome abnormalities in recurrent miscarriage. J Assisst Reprod Genet, 1999; 16: 253-258.