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1995 > Gynécologie > Cancer du sein  Telecharger le PDF

La protéine P53 dans la prise en charge des cancers du sein

C. Charpin

introduction

Parmi les facteurs pronostiques des cancers du sein, l'état des ganglions axillaires reste le meilleur indicateur pronostique en terme de récidive mais aussi de survie totale (1). Malheureusement, la sensibilité de ces facteurs pronostiques est relative puisque 20 à 30% des malades qui sont dépourvues de métastases ganglionnaires (N-) rechutent (2). Ce pourcentage devient en nombre absolu relativement important puisque, du fait du dépistage, beaucoup de cancers sont à l'heure actuelle N-. C'est pourquoi des efforts en matière de recherche appliquée ont été développés à différents niveaux pour essayer de mieux déterminer le pronostic des cancer du sein et de détecter parmi les patientes N- celles qui ont le plus de risque de mal évoluer et pour lesquelles un traitement adjuvant est à préconiser.

Les marqueurs de pronostic dans les cancers du sein sont de diverse nature, mais relèvent en général d'une anomalie génomique (par exemple mutation ou amplification) détectable par les techniques de biologie moléculaire (Southern, northern blots). Ces anomalies génomiques sont aussi indirectement mises en évidence par une modification de l'expression des protéines induites (western blot ou immunocytochimie).

Parmi les anomalies les plus importantes dans les tumeurs solides, celles qui concernent l'anti-oncogène p53 est actuellement la plus fréquemment rencontrée (3 - 8). L'anti-oncogène p53 code pour une protéine qui joue un rôle essentiel dans la régulation du cycle cellulaire (9). Le gène p53 est localisé sur le bras court du chromosome 17 (10) et les mutations rencontrées au cours des cancers humains se situent au niveau des exons 5 à 9 (11). Les mutations du gène p53 sont responsables d'une stimulation de la croissance cellulaire et dans la progression tumorale du fait de la perte de l'activité suppressive du gène p53 sauvage (12) et de sa coopération avec d'autres oncogènes activés (13).

La p53 a une demi-durée de vie courte et à l'état normal ne s'accumule pas dans les cytoplasmes cellulaires et de ce fait ne peut être détectable par les techniques immunohistochimiques (9). En revanche, les mutations de l'anti-oncogène p53 induisent une altération morphologique et fonctionnelle de la protéine qui devient stable et qui s'accumule dans les cellules (9). Cette accumulation intracellulaire dans les cancers de la protéine mutée permet la détection immunohistochimique de cette dernière dans les tissus et les cellules (14 - 17).

Les techniques immunohistochimiques (17 - 26) ont montré que 16 à 52% des tumeurs avaient une expression détectable de la protéine p53. Par ailleurs, il a été montré que les mutations de l'anti-oncogène p53, associées à une accumulation de la protéine p53, pouvaient représenter un marqueur potentiel de pronostic et de sélection du traitement adjuvant, puisque les patientes, dont les tumeurs étaient p53 positives et exprimaient fortement cette protéine, avaient des récidives plus précoces (15, 16, 27, 28) et une survie globale plus mauvaise (15, 27, 28).

Cependant, des résultats contradictoires ont été aussi publiés (18) et la fiabilité et l'intérêt clinique des tests immunohistochimiques utilisables en routine, contrairement aux techniques de biologie moléculaire plus lourdes et plus longues, restent discutables en l'absence de standardisation de la méthode (15 -29). Notamment, on peut discuter la valeur des anticorps monoclonaux utilisés bien que l'anticorps PAb 1801 commercialisé soit bien documenté et utilisé par la plupart des auteurs. De même, on peut discuter la valeur des tests immunohistochimiques effectués sur tissus ayant subi des traitements particuliers, notamment lors de la fixation et de l'inclusion en paraffine qui induisent des altérations antigéniques et peuvent introduire des biais méthodologiques, à savoir une perte de l'antigénicité contrairement aux techniques effectuées sur coupes de tissu frais et congelé (18, 25, 30).

Les différents travaux faisant allusion à la valeur pronostique de la détection de la p53 ont montré que non seulement l'expression elle-même de la p53 avait une valeur pronostique mais aussi que le nombre de cellules exprimant la p53 était aussi un facteur pronostique (16, 20, 24). L'aspect quantitatif d'une évaluation immunohistochimique reste donc un point important pour l'introduction de ce test en routine. Néanmoins, contrairement à ce qui était montré pour d'autres marqueurs tels que ki 67, les récepteurs hormonaux, la pHER-2/neu, la cathepsine D ou la pS2 (31 -40), aucun étude n'a encore fait état d'une immunohistochimie quantitative de la p53 dans les cancers du sein, alors qu'une telle approche a été évoquée pour le cancer de l'endomètre (5).

Dans notre étude, nous avons abordé ce problème en testant sur une série de 200 cancers du sein des coupes congelées avec l'anticorps monoclonal PAb 1801 anti p53 et en quantifiant les résultats obtenus par les réactions immuno-enzymatiques par une évaluation densitométrique et quantitative d'images microscopiques numérisées à l'aide d'un analyseur d'images. L'expression et la distribution de la p53 ont ensuite été corrélées à un certain nombre de paramètres tels que (i) l'âge des malades, la taille de la tumeur, le grade et le type histologique, (ii) la surexpression de la pHER-2/neu, la cathepsine D et l'expression des sites antigéniques des récepteurs aux oestrogènes et à la progestérone ainsi que de la pS2, évaluées de la même façon que la p53 et (iii) les marqueurs de prolifération cellulaire tels que le ki 67, la ploïdie, les AgNORs et les paramètres de morphométrie nucléaire.

matériel et méthodes

La série étudiée a porté sur 200 carcinomes mammaires palpables ou impalpables, traités par chirurgie première de 1992 à 1993 à l'Hôpital de La Conception à Marseille. L'âge des patientes se situe de 30 à 88 ans (en moyenne 55,3 ans ± 11,5). La taille de la tumeur varie de 4 à 70 mm avec une taille moyenne de 18,7 mm ± 12, 21% des tumeurs mesurant de 10 mm. L'examen microscopique standard a porté sur des coupes en paraffine colorées à l'HPS. Les tumeurs ont été classées et gradées selon la classification de l'OMS (41) et le système de grading de Bloom et Richardson (42).

Technique immunohistochimique

Les fragments tissulaires prélevés au moment de l'intervention par l'anatomo-pathologiste ont été immédiatement congelés au moment de l'examen extemporané. La taille des fragments congelés a varié en fonction de la taille de la tumeur. Quelle que soit néanmoins la taille de la tumeur, les prélèvements effectués ont toujours été contrôlés afin de vérifier qu'ils étaient représentatifs de la tumeur (corrélation avec l'examen histologique sur coupe en paraffine). Les fragments tumoraux ont ensuite été stockés à - 80° à la tumorothèque du laboratoire. Les immunodétections ont été effectuées sur coupes séquentielles de 5 microns d'épaisseur. Dans 91 cas les immunodétections ont aussi été effectuées sur coupes en paraffine pour comparer la différence entre test sur coupe congélée et coupe déparaffinée.

Les différents anticorps utilisés sont des anticorps commercialisés : monoclonal anti p53 (clone PAb 1800), Cliniscience, anti pS2, Cis-Bio; Ki 67, Immunotech; anticathepsine D, Biosys; anti pHER-2/neu, Cliniscience; anticorps monoclonal anti-récepteurs aux oestrogènes et à la progestérone, Abbott.

La technique immunoenzymatique utilisée est l'avidine biotine peroxydase ou la streptavidine biotine peroxydase (43, 44). Pour la détection des sites antigéniques des récepteurs, la technique peroxydase-antipéroxydase incluse dans le kit Abbott a été utilisée (31 - 33).

Histochimie

Les appositions cellulaires effectuées lors de l'intervention à partir de tissu frais avant congélation dans l'azote liquide ont été effectuées et très rapidement fixées dans les fixateurs appropriés pour colorations de Feulgen (45) et des AgNORs (46) différées.

Analyse d'images

Les résultats obtenus par technique immuno-enzymatique sur lames ont été évalués par densitométrie sur images microscopiques numérisées. La quantification des immunoprécicipés est effectuée grâce au logiciel développé spécifiquement pour l'immunohistochimie sur le système SAMBA 2500 (Alcatel TITN, Grenoble, France) (47). Deux paramètres ont été essentiellement pris en compte dans cette analyse : le pourcentage de surface marquée (par rapport à la surface contricolorée) et la densité optique moyenne (31 - 33, 39, 40). L'analyse de la ploïdie après coloration de Feulgen utilisant le programme ploïdie du système SAMBA a été utilisée comme dans les études précédentes (48). Les paramètres fournis par cette analyse sont au nombre de 4 : l'index de ploïdie (1 pour les cellules diploïdes), la balance de ploidie (variant de -100% à +100%), le degré d'hyperploïdie et l'index de prolifération. Le système d'analyse d'images a aussi été utilisé pour mesurer la quantité d'AgNORs au niveau des noyaux cellulaires (49).

Analyse statistique

Différents tests statistiques paramétriques et non paramétriques ont été utilisés en fonction du type de variables étudiées (qualitatives ou quantitatives) et de leur distribution (normale ou pas) (50).

résultats

distribution de la p53 dans les tumeurs

Sur coupe à congélation, la positivité avec l'anti p53 n'a été observée que dans les cellules tumorales. L'antigène est irrégulièrement distribué dans les noyaux cellulaires. Dans la plupart des tumeurs positives, seules quelques cellules sont marquées avec l'anti p53, dispersées dans la prolifération tumorale. Dans quelques rares cas, la positivité nucléaire est au contraire très forte, avec une majorité de cellules positives. D'une façon générale, l'immunomarquage est très intense bien qu'hétérogène.

Sur les coupes en paraffine, les immunoréactions sont différentes, d'intensité beaucoup plus faible, avec beaucoup moins de cellules positives que sur coupes à congélation. De plus, en paraffine, il existe une diffusion de l'immunomarquage avec débordement de la positivité du noyau vers le cytoplasme. Globalement, il y a une perte d'antigénicité puisque 14 des 91 tumeurs positives sur coupes à congélation se sont révélées être négatives sur coupes en paraffine. Par ailleurs, la fixation des tissus fixés en paraffine induit un bruit de fond important gênant l'évaluation quantitative des résultats.

Étude immunohistochimique quantitative de la p53

Sur coupes à congélation, 45,7% des tumeurs sont p53 positives. L'analyse densitométrique montre que les surfaces p53 positives sont faibles, étendues de 1 à 28% (9,5% ± 8,1%). Dans 58% des cas, la surface positive est de moins de 10% et dans 77% des cas, de moins de 15%. La corrélation de l'analyse densitométrique sur coupes en paraffine congelées montre qu'il y a une perte d'information très nette, liée à la fixation et à l'inclusion en paraffine.

L'étude des densités optiques moyennes, directement corrélées à l'intensité de l'immunomarquage, montre une forte positivité allant de 40 à 140 (moyenne 83,6 ± 25,1 unités) (échelle d'unités arbitraires allant de 0 pour le noir à 255 pour le blanc).

Corrélations et étude statistique

p53 et données morphologiques

L'expression de la p53 détectée en immunohistochimie s'est révélée être indépendante de la taille de la tumeur, des embols vasculaires, du statut ganglionnaire et de l'âge des malades. Néanmoins, l'expression de la p53 est corrélée au grade histopronostique avec faible expression dans les tumeurs de grade I et forte expression dans les tumeurs de grade III (p < 0,01). Parmi les cancers canalaires infiltrants, ceux à forte composante intracanalaire de type comédocarcinome expriment très fortement la p53, et plus que la moyenne des autres carcinomes canalaires (p = 0,027). Inversement, les carcinomes lobulaires expriment peu la p53 et significativement (p < 0,001) moins que les carcinomes canalaires infiltrants.

p53 et marqueurs moléculaires

Une corrélation significative mais inverse a été observée entre l'expression de la p53 et l'expression des sites antigéniques des récepteurs aux oestrogènes et à la progestérone et de la pS2 (p <0,01). L'expression de la p53 détectable par technique immunohistochimique est positivement et significativement corrélée à l'immuno-marquage par le Ki 67 (p = 0,018) mais est indépendante de l'expression de la pHER-2/neu (p = 0,6) et de la cathépsine (p = 0,4). De même, la p53 est indépendante de l'index de DNA et de la balance de ploïdie mais est significativement corrélée au degré d'hyperploïdie, et à l'index de prolifération (p <0,01). L'expression de la p53 est aussi significativement reliée à la surface des AgNORs nucléaires (p = 0,02). Aucune relation n'a cependant été observée entre les paramètres de morphométrique nucléaire et l'expression histochimique de la p53.

discussion

Les techniques immunohistochimiques sur coupes de tissu permettent la détection de formes stabilisées de la p53 dans les noyaux des cellules tumorales. L'expression cytoplasmique relève essentiellement d'artéfacts techniques liés au mode de fixation et à la modification des températures (chaleur) nécessaire à l'inclusion en paraffine. ou aux trop fortes concentrations d'anticorps (15).

La p53 est détectée dans 16 à 52% des cancers du sein (14 - 26). Dans notre série 47,5% des cancers se sont révélés positifs avec l'anti p53 sur coupes à congélation, bien que souvent très faiblement. Ces résultats corrèlent bien les données de la littérature puisque différentes séries ont montré un score de positivité de 42,5% (20) ou 45,5% (14) ou 52% (16) sur des séries importantes et coupes à congélation aussi. Néanmoins, dans les séries ayant utilisé du matériel fixé et où les immunodétections ont été effectuées sur coupes en paraffine, l'expression est moindre, montrant des scores de positivité de 16% (8), 25% (26), 25,8% (23) et 28% (25). Récemment, il a même été montré que parmi tous les anticorps utilisables, seuls quelques uns donnent des réactions positives sur coupes en paraffine.

Ces résultats montrent donc que l'utilisation de l'immunohistochimie sur coupes en paraffine est sujette à caution car il existe manifestement une perte incontrôlée et incontrôlable de l'antigénicité. C'est pourquoi toute évaluation quantitative des résultats immunohistochimiques effectuée sur ces matériels est sujette à caution, notamment si ces tests sont utilisés à des fins pratiques et cliniques telles que l'évaluation du pronostic et l'indication thérapeutique post-chirurgicale.

Dans notre étude, nous avons pu montrer que l'immunodétection sur coupes en congélation était nettement plus performante que sur coupes en paraffine, ce qui corrèle bien les données de la littérature.

La plupart des études ayant corrélé l'expression de la p53 au pronostic ont utilisé une évaluation semi-quantitative pour apprécier l'importance des immuno-marquages (16, 20, 21, 24, 28). Bien que ces méthodes soient communément utilisées et faciles à appliquer, elles manquent de précision et de reproductibilité et sont intimement liées à la subjectivité de l'examinateur. L'évaluation quantitative par densitométrie sur images microscopiques numérisées utilisant des appareillages commercialisés, notamment des analyseurs d'images, permet une approche quantitative des résultats immunohistochimiques beaucoup plus rationnelle (31 -40).

Les programmes disponibles sur ces systèmes ont déjà été appliqués pour d'autres marqueurs (31 - 40) et se sont révélés entre nos mains parfaitement utiles et utilisables pour l'évaluation quantitative de la p53 après détection immuno-enzymatique sur coupes de tissu (immunohistochimie).

Dans notre matériel, l'expression de la p53 s'est révélée être indépendante de l'âge de la malade et de la taille de la tumeur (14, 18, 20). La surexpression de la p53 apparaît à la phase précoce des cancers, puisqu'on l'observe dans près de 25% des carcinomes in situ (15, 55, 56) et cette surexpression est maintenue et augmentée avec la progression des cancers puisqu'on l'observe dans 50% des cancers du sein avec métastases (55). Néanmoins, nous n'avons pas pu observer dans notre matériel des différences significatives entre les in situ et les invasifs, contrairement à d'autres auteurs (15), vraisemblablement parce que notre échantillon de carcinomes in situ était trop faible. Les données de la littérature montrent que les cancers lobulaires expriment peu la p53 comme dans notre matériel (20) et que les carcinomes médullaires étaient fortement p53 positifs (25). Dans notre série, aussi l'expression des carcinomes lobulaires est plus faible que celle des carcinomes canalaires invasifs.

Dans la plupart des études immunohistochimiques de la p53, il existe une corrélation entre le grade et la tumeur et les surfaces p53 positives (18, 20 - 23, 25, 27). Nos résultats corrèlent bien ceux de la littérature bien que paradoxalement la morphométrie nucléaire ne montre aucune corrélation entre les paramètres morphométriques des noyaux et les surfaces p53 positives sur coupes à congélation. Dans notre matériel, nous avons montré une absence de corrélation entre l'état des ganglions axillaires et l'expression de la p53 comme dans d'autres études (20, 26) bien que l'état ganglionnaire soit un facteur pronostique unanimement reconnu (15, 16, 27). Habituellement aussi, la p53 est inversement corrélée aux récepteurs aux oestrogènes (11, 14, 15, 18, 20 - 23, 26) et aux récepteurs à la progestérone (11, 19, 23). Ces données suggèrent que la p53 intervient dans la régulation des récepteurs hormonaux et peut jouer un rôle dans l'hormonodépendance des tumeurs.

Dans les tumeurs du sein, les altérations génomiques peuvent ête multiples. En particulier, on sait que l'amplification de l'oncogène HER-2/neu et la surexpression de la protéine induite sont souvent observées, (50 - 58) en association avec une surexpression de la p53 (18, 20 - 24, 59). De même, on a montré que la p53 était corrélée à une surexpression de l'EGFR (20) qui comme la pHER-2/neu et la cathepsine D (57 - 60) est un facteur pronostique. Néanmoins, dans notre étude, nous n'avons observé aucune corrélation entre la cathepsine D et la pHER-2/neu d'une part et l'expression de la p53 d'autre part.

L'anticorps monoclonal ki 67 reflète la fraction de croissance tumorale. Cette dernière, dans notre matériel, est corrélée à l'expression de la p53, comme ceci avait d'ailleurs été montré dans d'autres études (14, 19, 23). Dans notre matériel aussi, la p53 est significativement corrélée au degré d'hyperploïdie, à l'index de prolifération ainsi qu'aux AgNORs. Ces données ne sont pas surprenantes dans la mesure où la p53 est déjà corrélée au grade des cancers du sein qui est un indicateur pronostic significatif.

En conclusion, il faut considérer que l'accumulation dans le noyau des cellules tumorales de la protéine p53 induite par l'anti-oncogène p53 muté, peut être évaluée par technique immunoenzymatique sur coupes de tissu et dans l'avenir pourra être utilisée pour l'évaluation du pronostic dans la mesure où les techniques sont standardisées, c'est à dire s'ils sont effectués sur coupes à congélation et si les résultats sont évalués par densitométrie sur images microscopiques numérisées (analyse d'images).

Dans une série récente de 200 carcinomes dans lesquels ces conditions techniques ont été respectées, on a pu montrer que l'expression de la p53 est indépendante de la taille de la tumeur, du statut ganglionnaire axillaire et de l'expression d'autres oncoprotéines et marqueurs moléculaires telles que la pHER-2/neu et de la cathepsine D. Néanmoins, la p53 détectée est inversement corrélée aux récepteurs hormonaux et à la pS2 et positivement corrélée au grade de la tumeur, à l'expression de Ki 67, à l'hyperploïdie et aux AgNORs qui sont des témoins de l'activité de prolifération cellulaire. Ces résultats montrent que l'expression de la p53 dans les tumeurs du sein est un facteur pronostique pas totalement indépendant.

La nécessité de l'immunodétection sur coupes congelées et d'une standardisation de l'évaluation des résultats par analyse d'images ayant été démontrée dans cette première étude, il reste maintenant à vérifier, sur une série rétrospective (matériel stocké en tumorothèque) la réelle signification pronostique du p53 (en terme de récidive, de taux de métastases et de survie globale) par une étude type Kaplan-Meier. De même, il faudra vérifier la force de ce marqueur pronostique parmi les autres par une étude multivariate type modèle de Cox (étude prospective en cours).

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Service d'Anatomie Pathologique et EA 875, Oncogénèse des tumeurs solides CHU Timone, 27 Bd Jean-Moulin Marseille 13385.