Introduction Le but de la Fécondation in vitro et de la culture embryonnaire est de fournir des embryons haute qualité capable de continuer leur développement, de réaliser leur implantation, pour finalement donner des descendants viables. Depuis les premières études sur les cultures d'embryons, des progrès considérables ont été réalisés. Avec d'autres, (Tervit et al. 1972), nous avons débuté dans les années 70 ,la réalisation de milieux complexes basés sur les sécrétions génitales femelles. Malgré ces efforts, des retards de développement apparaissent toujours in vitro (Humain:Bolton et al. 1989). Ceci amène à des arrêts de développement au moment de la mise en route du génome embryonnaire (Poueymiriou et al. 1989). Avant la mise en route du génome embryonnaire, il n'y a en effet pas (ou très peu) d'activité transcriptionnelle. Aussi, à la fin de la maturation, l'ovocyte doit contenir les ARN messagers et les protéines nécessaires aux premières étapes de développement i.e les systèmes métaboliques nécessaires et au bon équilibre. De plus, le cycle pendant lequel démarre l'activation génômique est le cycle le plus long du développement préimplantatoire. Tout retard à ce moment se traduira par un blocage du fait d'une chute des réserves en deçà d'un seuil critique. Il est dorénavant connu que la composition des milieux de culture a un impact sur les activité transcritionnelles et traductionnelles de l'embryon (Ho et al. 1994, Jung 1989). Le métabolisme embryonnaire est ralenti in vitro alors que le turnover des protéines est au contraire accéléré. Une diminution sévère de la viabilité (Bolton et al. 1989, Bowman et Mc Laren 1970) , et un nombre de cellules anormalement bas (Human: Vlad et al; 1996) est aussi observé. L'impact d'un nombre trop faible de cellules est évident: au moment de l'éclosion, ce sont les lysines de cellules du trophecoderme qui entame la dégradation de la zone pellucide. C'est la formation chronologiquement et morphologiquement normale du blastocyste qui est le meilleur indicateur de la qualité embryonnaire. La détermination finale étant le grossesse après transfert. Il y a, de toute évidence, des changements dynamiques dans l'environnement embryonnaire lors de son transit dans les voies génitales femelles (Rousseau et Ménézo 1993). Deux solutions sont proposées pour "coller"aux besoins embryonnaires: des changements séquentiels de milieux ou un changement dynamique du milieu de culture par l'utilisation de tapis cellulaires (cocultures). Nous avons essayé ici de prendre en compte les études validées par des transferts embryonnaires, ce qui est rarement le cas. Cocultures: Les cultures organotypiques de l'embryon dans l'oviducte,ont constitué les premières cocultures embryonnaires. Elles étaient bien sûr basées sur les interactions paracrines (Biggers et al. 1962). Il a été alors successivement démontré que le priming hormonal de l'oviducte n'est pas nécessaire, puis que l'origine génitale des cellules n'était pas nécessaire. (Camous et al. 1984, Ménézo et al. 1990). La technique de coculture diffère totalement de la culture embryonnaire classique. Le choix du milieu est capital: il a à satisfaire aux besoins de l'embryon et du tapis cellulaire. Des effets faux positifs et des faux négatifs sont directement liés au milieu de culture (Xu et al. 1992). Dans le même ordre d'idée, la présentation des cellules (suspension, tapis à confluence ou non) interfère avec les résultats. Les embryons cocultivés ont toujours un nombre de cellules plus important que les embryons cultivés en milieux seuls (Vlad et al. 1996, Goodeaux et al. 1989). Deux expérimentations récentes ont montré l'importance des facteurs techniques (Vlad et al. 1996, Van Blerkom 1993, Tableau 1).En association avec le nombre de cellules, la quantité de matière sèche est également plus importante en cas de coculture(Turner et al. 1994). Un aspect important dans le compréhension des effets de la coculture est l'interaction avec les voies métaboliques. S'il y a des déficits dans le stockage des enzymes et des ARN messagers dans l'embryon, il peut se produire des "culs de sacs" du fait de l'impossibilité de métaboliser certains composés. Il se produit une perte d'énergie associée à l'accumulation de composés inutiles. Un bon exemple est celui du métabolisme du glucose In vitro, dans les milieux trop simples, le glucose conduit à l'accumulation du glycogène; ceci ne se produit ni in vivo , ni in vitro en coculture (Khurana and Wales 1987). Ceci ne peut être expliqué par une chute de la concentration en glucose du fait du métabolisme des cellules (Ouhibi et al. 1990). Plus vraisemblablement, le tapis cellulaire fournit, du fait de son propre métabolisme, des petites molécules permettant à la machinerie cellulaire de l'embryon de fonctionner avec un maximum d'efficacité. Le glucose est de fait nécessaire pour les embryons précoces. De façon évidente le glucose et la glutaine sont présents dans l'environnement embryonnaire durant son transit dans les voies génitales femelles (Rousseau and Ménézo 1993). Les cellules du tapis cellulaire contribuent également à optimiser le niveau d'acides aminés. Elles contribuent à un potentiel red-Ox réducteur: par la synthèse et le relargage de composés réducteurs comme le glutathion et l'hypotaurine, qui est un effecteur important du développement embryonnaire précoce (Barnett and Bavister 1992). Une enzyme spécifique (la cystéine sulfinate décarboxylase) est responsable de la synthèse d'hypotaurine dans l'environnement tubaire.Ces agents réducteurs ont également des effets antiradicalaires. Il préviennent la peroxydation des lipides et d'autres composés comme cystéine et méthionine. Le catabolisme des aminoacides peut rendre le milieu toxique du fait de l'accumulation d'ammoniac, quand la culture est réalisée sous huile. In vivo, ou en coculture, l'ammoniac est recyclé par voie enzymatique (Ménézo et al. 1993, Lane and Gardner 1995), avec formation d'alanine, d'acide aspartique/ asparargine et d'acide glutamique/glutamine. La présence de facteurs embryotrophiques spécifiques dans les voies génitales femelles est improbable. Une ubiquité est plus probable. (Paria and Dey 1990). Des facteurs de croissance et leurs récepteurs sont présents dans l'embryon (Adamson 1993, (Watson et al. 1992)). Les facteurs de croissance sont des candidats potentiels aux effets autocrines. Cependant il est probable que l'embryon n'est pas capable d'utiliser ses propres facteurs de croissance "en boucle". Par contre, la culture des embryons en groupe permettrait des interactions positives d'embryon à embryon.. Chia et al (1993) ont démontré la nécessité d'un apport exogène (paracrine) de facteurs de croissance, notamment EGF, chez l'homme. En effet , il existe une extinction provisoire de ce facteur et de son récepteur dans le trophectoderme. Les cellules Vero et MDBK sécrètent en permanence EGF; ce n'est pas le cas des cellules de l'oviducte de certaines espèces. Thibodeaux et al. (1993) ont montré que les facteurs de croissance agissent en synergie. Si une voie est bloquée, un autre facteur de croissance pourra stimuler l'embryon. Les cellules de l'utérus (et les cellules Vero) secrètent du LIF (leukemia inhibitory factor), qui stimulent le développement et l'implantation du blastocyste de Souris (Kauma and Matt 1995). Rien n'a été démontré quant au rôle du LIF chez l'homme. Les milieux séquentiels Les progrès apportés par la coculture et en général par une meilleure connaissance de la biochimie de l'embryon ont poussé les systèmes de culture sans coculture. De fait, il y avait un besoin de changer à la fois de formules et de concepts, pour "suivre" au plus prés les besoins de l'embryon, d'abord avant l'activation génômique puis après. Il est maintenant évident que les aminoacides sont nécessaires dès la fécondation. Ils sont même nécessaires pour des manipulations de courte durée de l'embryon. L'utilisation d'une teneur en C02 de 5% peut favoriser la formation des Blastocystes. C'est plutôt une trop forte concentration externe en glucose dans un milieu trop simple qui rend le milieu inadéquat, plutôt que le glucose per se. Ali et al. (1993), de même que Gardner et Lane (1996) n'ont pu démontrer aucun effet toxique du glucose quand de la glutamine et d'autres aminoacides sont ajoutés dans le milieu de culture. L'idée d'enlever le glucose et les phosphates du milieu de culture ne semble pas physiologique, mais ceci est le cas de quelques milieux de culture commerciaux.(Quinn 1997). Au contraire, le pyruvate est un composé doublement intéressant: c'est une source d'énergie majeure pour les embryons aux stades précoces et un facteur de detoxyfication de l'ammoniac par transamination, formation d'alanine et re-export de l'alanine formée (fig 1). La glycine est l'acide aminé majeur des sécrétions génitales femelles: il est immédiatement catabolisé en Glycollate et glyoxyllate (Khatchadourian et al. 1994) avec perte d'ammoniac. La glycine agit en synergie avec la taurine et la glutamine. Dans les milieux séquentiels, la formation d'ammoniac impose de changer les milieux au moins tous les 2 jours, si la culture est réalisée sous huile. Dans l'état actuel des connaissances, l'albumine est encore nécessaire dans les milieux de culture. EDTA est ajouté pour la culture des stades précoces: il sert d'agent antiradicalaire par "piegeage" des ions Fe et Cu. L' EDTA serait délétère après l'activation génômique et doit donc être éliminé dans la seconde phase de culture (Gardner et Lane 1996). Les facteurs de croissance sont présents dans les milieux de culture après activation génômique. Insuline du fait de son action sur le métabolisme protéique et EGF sont des effecteurs importants. Cependant, la composition des milieux de culture est dorénavant tenue de plus en plus confidentielle, ce qui interdit une analyse plus poussée des interactions. Analyse comparée des "séquentiels" et de la coculture Il est clair qu'au vu des derniers résultats sur les milieux séquentiels (Voir Gardner 1997, Chouteau et al. 1997), ils ont dorénavant acquis une place prépondérante. Par contre, il est toujours vrai que les facteurs paternels et maternels peuvent interférer avec les résultats obtenus. La formation de blastocyste est voisine de 50% en séquentiels comme en coculture.Sur les 50% des embryons bloqués en culture, la moitié l'est pour des raisons cytogénétiques (Benkhalifa et al. 1996). Le tableau 2 donne les résultats comparés. Conclusion Les succès assez faibles obtenus en culture embryonnaire (surtout de longue durée) a longtemps compromis l'essor des biotechnologies liées à la reproduction. Dans un premier temps, la coculture a permis de résoudre une partie de ces problèmes: maintien de la qualité embryonnaire après culture prolongée avec des taux d'implantation satisfaisants après transfert (Bongso et al. 1991, Freeman et al. 1995). Elle permet de plus une sélection cytogénétique des embryons (Benkhalifa et al. 1996). Enfin, la capacité à subir le processus de congélation/décongélation est bonne. L'approche empirique pour définir de nouveaux milieux de culture a été un échec jusqu'au moment où les connaissances ont permis de mieux comprendre les interactions entre les embryons et le milieu. C'est l'abandon de l'idée qu'un milieu simple seul pouvait permettre d'obtenir des Blastocystes avec un rendement correct qui a également fait avancer les concepts. Dorénavant l'utilisation de milieux séquentiels semble efficace; il reste cependant à déterminer leur efficacité réelle sur un plus grand nombre de patientes et déterminer leur impact sur les enfants nés. Enfin, l'aptitude à supporter la congélation doit également être définie. Il semble néanmoins évident que le transfert au stade blastocyste ne devrait plus être l'exception mais la règle. Bibliographie Adamson E.D. Activities of Growth factors in preimplantation embryos. J. Cell. Biochem., 53, 280-287, 1993 Ali J. , Whitten W.K., Shelton J.N. Effect of culture systems on mouse eearly embryo development. Human reprod. , 8, 1110-1114, 1993 Barnett D.K. and Bavister B.D. Hypotaurine requirement for in vitro development of golden hamster one-cell embryos into morulae and blastocysts, and production of term offspring from in vitro fertiliozed ova. Biol. Reprod. 47, 297-304, 1992 Benkhalifa M., Ménézo Y., Janny L. et al. Cytogenetics of uncleaved oocytes and arrested zygotes in IVF programs. J. Assist. Reprod. Genet., 13,140-146, 1996 Bertheussen K., Forsdahl F., Maltau J.M. In vitro fertilization. New media for embryo culture to the blastocyst stage. Proc. 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Laboratoire Marcel Mérieux, 1 Rue laborde BRON France et Clinique Belledone, Grenoble |
