Assistance a l’éclosion embryonnaire
Auteurs :
Martine DUMONT(1,2) ; P. COHEN-BACRIE (1), A. LE MEUR (1), A. HAZOUT (3), F.
OLIVENNES(4), R FRYDMAN (4).
AMP EYLAU
- Laboratoire d'Eylau 55, rue Saint Didier 75116 PARIS
- Clinique P . CHEREST ,5, rue Pierre CHEREST 92200 NEUILLY SUR SEINE
- Clinique de la Muette 46-48, rue Nicolo 75116 PARIS
- Hôpital Antoine BECLERE, 157, rue de la Porte de Trivaux 92141 CLAMART
INTRODUCTION
Ces dernières années deux techniques ont été proposées pour tenter
d'augmenter le taux d'implantation des embryons obtenus par fécondation in
vitro. L'une de ces techniques est la culture prolongée d'embryons soit sur
tapis cellulaires soit en milieux simples, l'autre est l'éclosion assistée qui
consiste à perforer la zone pellucide des embryons précoces pour faciliter leur
éclosion ultérieure.
In vivo, la perte de la zone pellucide par le blastocyste est un phénomène
étroitement lié à l'implantation : si cette étape du développement
embryonnaire intervient en retard ou ne se fait pas, alors l'implantation
embryonnaire sera compromise. Le mécanisme d'éclosion de l'embryon n'est
pas clair. La majorité des informations sur l'éclosion des blastocystes a été
obtenue à partir d'études in vitro car l'éclosion naturelle (in vivo) est
difficile à observer.
ECLOSION SPONTANEE DE L'EMBRYON
In vitro, l'expansion du blastocèle des embryons de mammifères s'accompagne
d'un amincissement de la zone pellucide (ZP) puis celle-ci se rompt :
l'excroissance du trophectoderme apparaît à l'extérieur de la ZP et
l'éclosion se poursuit et s'achève par une large ouverture de la ZP.
FACTEURS EMBRYONNAIRES IMPLIQUES DANS LA PERTE DE LA ZONE PELLUCIDE IN
VITRO
Les protéases :
Des études menées in vitro chez la souris ont montré que si l'on met des
inhibiteurs de protéases dans le milieu de culture des embryons ; on inhibe
l'éclosion, puis PERONA et WASSARMAN ont montré que les cellules du
trophectoderme produisaient une protéine trypsine like qu'ils ont appelé
" strypsin " (1) SWADA et CollL ont également
identifié une protéine trypsine like dans le milieu de culture de blastocystes éclos de
souris.
La pression exercée par l'expansion du blastocyste et expression des
" TEP " ( Trophectoderm Projections) :
En filmant le développement embryonnaire in vitro, COLL, a montré que chez la
souris ; il y avait des cycles de contraction et ré-expansion du blastocyste juste
avant l'éclosion ; d'où l'idée que l'expansion du blastocyste
devait exercer une pression sur la ZP favorisant ainsi l'amincissement de la ZP et
l'éclosion (2).
Chez 6 autres espèces : le cobaye, le hamster, le singe, les bovins, les équins
et l'humain ; cette activité cyclique s'accompagne de l'apparition
des " TEP " ( projections cytoplasmiques émanant du trophectoderme et
qui traversent la zone pellucide). Les " TEP " qui apparaissent
uniquement au stade blastocyste et dans une région précise de l'embryon sont
également soumis à des cycles rapides d'extension et de rétraction. Leur présence
in vivo a été montrée chez le cobaye et le hamster. Les " TEP "
seraient impliqués dans un ou plusieurs événements clés du développement précoce
tels que : éclosion embryonnaire, attachement et/ou implantation du blastocyste. (GONZALES
et Coll, 1996 (3))
INTERVENTION DU MILIEU UTERIN DANS LA PERTE DE LA ZONE PELLUCIDE
Le milieu utérin n'est pas indispensable à l'éclosion proprement dite
puisque la perte de la ZP peut se produire dans un environnement extra-utérin ; que
ce soit un vivo (oviducte de souris ; chambre antérieure de l'il ;
grossesses extra-utérines chez la femme) ou in vitro.
Cependant il est probablement indispensable à une implantation réussie in utéro,
c'est-à-dire à la survenue d'une éclosion embryonnaire en phase avec un
endomètre réceptif. En effet, chez la souris, Mc LAREN a montré que
l'environnement utérin pouvait avoir des conséquences sur le temps d'éclosion
des embryons. Si l'implantation embryonnaire est interrompue,par l'ovariectomie
au jour 2 ou 3 de la gestation, ou par la lactation ; autrement dit si l'embryon
est soumis a un environnement hormonal " neutre " ou dominé par la
progestérone ; l'éclosion du blastocyste est différée de 24 heures et la ZP
est retrouvée vide, non dissoute. Si par ailleurs l'implantation est induite en
injectant de petites quantités d'strogènes ; la lyse de la ZP intervient
dans les 18 heures qui suivent les injections. Ces expériences suggèrent donc que
l'utérus produit un facteur lytique oestrogéno - dépendant responsable de la lyse
de la ZP.
Une étude plus récente de GONZALES et BAVISTER chez le hamster,
comparant l'éclosion spontanée in vivo et in vitro, montre également qu'in
vivo il y a lyse complète de la ZP.
Toutes ces observations suggèrent que in vivo, deux mécanismes interviendraient dans
la perte de la ZP :
- Un facteur lytique utérin hormono - dépendant.
- Un procédé actif d'éclosion engagé par le blastocyste indépendamment
d'un stimulus hormonal.
ECLOSION " ASSISTEE " DE L'EMBRYON ou
" ASSISTED HATCHING " (AH)
L'hypothèse que des défauts d'éclosion pouvaient être responsables
d'échecs d'implantation a été émise par COHEN et Coll en 1990 (4)
suite à 2 observations :
1 - L'analyse rétrospective de l'aspect morphologique des embryons et du
résultat de leur transfert a montré que les embryons à ZP épaisse s'implantaient
beaucoup moins que les embryons à ZP fines et irrégulières (10% contre 25%)
2 - Les embryons issus d'une fécondation assistée par PZD ( " Partial
Zona Dissection " ) s'implantaient mieux que les embryons à ZP intacte.
D'ou l'idée que la capacité à éclore des embryons pouvait être augmentée
par un amincissement artificiel de la ZP ou par la création d'un trou dans la ZP .
D'autre part, on sait que les conditions de culture in vitro ; ou un
vieillissement in vivo des ovocytes peuvent induire un " durcissement de la zone
pellucide, c'est à dire une augmentation de la résistance de la ZP à sa
dissolution par différents agents chimiques et enzymatiques (souris, femme)
LES TECHNIQUES D'ECLOSION ASSISTEE
- " PZD " (Partial Zona Dissection)
C'est une technique mécanique qui consiste à embrocher la ZP avec une aiguille
de verre et à frotter le segment sous tendu contre la pipette de contention, on réalise
alors une incision de taille variable.
- Perforation au tyrode acide
L'application d'une solution de tyrode acide (pH 2,3) permet de dissoudre la
ZP ; réalisant ainsi un orifice rond et large.
- Perforation au laser
Le principe est le même que celui de la technique au tyrode acide, cependant cette
technique est très coûteuse.
- Amincissement de la ZP
- Au tyrode acide (souris)
- Au laser (femme)
ETUDE IN VITRO DES CONSEQUENCES DE LA MICRO-MANIPULATION DE LA ZP SUR
L'ECLOSION DE L'EMBRYON
Une étude in vitro sur les embryons de souris, comparant la technique de perforation
au tyrode acide (TA) a montré que la taille de l'ouverture est déterminante pour le
devenir de l'embryon. Si par la technique PZD, on réalise une incision trop étroite
£ 5µm ; on obtient seulement 22% d'éclosions complètes
(contre 72% si l'incision est de 11 à 25µm) ; la plupart des embryons pouvant
être piégés dans la zone pellucide conduisant ainsi à des anomalies d'éclosion.
Deux études portant sur la culture d'embryons humains frais (5) ou congelés(6)
après éclosion assistée par PZD n'ont pas retrouvé d'anomalies
d'éclosion des embryons.
Selon COHEN et Coll, la technique de perforation au tyrode acide semble la mieux
adaptée car elle permet de réaliser des trous de taille constante ; suffisamment
larges et ronds pour permettre une éclosion totale des embryons sans traumatisme (92%
d'éclosions complètes).
Cette technique est par ailleurs utilisée pour le diagnostic pré-implantatoire des
embryons par HANDYSIDE et COLL (7) et permet un taux d'implantation embryonnaire
satisfaisant.
MODELES ANTI HATCHING POUR EVALUER LE BENEFICE APPORTE PAR
L'ECLOSION ASSISTEE AU TYRODE ACIDE
Le modèle souris n'est pas un modèle directement transposable à l'homme
puisque tous les embryons cultivés in vitro à partir du stade 2 cellules peuvent
éclore.
Ce modèle permet surtout de montrer l'éffet délétère éventuel d'une
technique de Hatching mais pas son éffet bénéfique.
Il était donc nécessaire de créer un modèle d'embryons ayant un développement
normal excepté pour leur capacité à éclore.
Deux modèles souris ont été proposés pour l'inhibition de l'éclosion
embryonnaire in vitro :
1- La culture d'embryons dans des conditions non optimales ; culture en
milieu sans protéines induisant un durcissement de la zone pellucide et une inhibition de
l'éclosion (10% d'éclosions complètes contre 87% dans le groupe témoin) (8).
2- La destruction d'un blastomère au stade 4 cellules afin d'obtenir des
blastocystes plus petits dont le taux d'éclosions in vitro est réduit (58% contre
83% chez les témoins) (9).
Dans ces 2 modèles le défaut d'éclosion est corrigé par une technique
d'éclosion assistée au tyrode acide (amincissement ou perforation de la ZP)
permettant de restaurer un bon taux d'implantation in vivo (26% à 37%)
ECLOSION " ASSISTEE " : APPLICATION
CLINIQUE
L'équipe pionnière de COHEN et Coll (4,10) dans une étude portant sur 330
couples et plusieurs essais randomisés a montré que :
L'éclosion assistée appliquée a une population non sélectionnée
n'augmentait pas significativement les taux de grossesses et d'implantation.
Chez les femmes d'âges inférieur à 39 ans et à FSH normale ; seuls les
embryons ayant un ou plusieurs critères morphologiques défavorables pour
l'implantation (ZP ³ 15µm ; moins de 5 cellules à
J3 , excès de fragmentation > 20%) doivent être soumis à l'éclosion
assistée.
Seules les femmes d'âge supérieur ou égal à 39 ans et/ou à FSH élevée (>
15 UI) pouvaient bénéficier de l'éclosion assistée appliquée sur la totalité
des embryons transférés.
ANALYSE DES RESULTATS EN FONCTION DES INDICATIONS
1- Femmes d'âges supérieur ou égal à 39 ans
Parmi les études publiées (tableau 1) seules trois d'entre elles rapportent un
meilleur taux de grossesses et d'implantation dans le groupe de patients avec
éclosion assistée. Dans notre expérience (tableau 2) les techniques d'éclosion
assistée ne semblent pas avoir d'éffets délétères sur les embryons mais ne
semblent pas non plus améliorer le taux d'accouchement dans cette catégorie de
patientes. Ces résultats corroborent ceux de BIDER et Coll, 1997 , qui ne montrent
pas de différence significative entre le groupe contrôle et le groupe
" hatching " pour lesquels ils trouvent respectivement : 3,8%
d'enfants nés par transfert contre 3,3%.
2- Femmes à FSH de base élevée
Seul COHEN et Coll (4) ont rapporté une petite étude randomisée portant sur 30
patientes. Cette courte série a permis d'obtenir 26% d'implantation par embryon
transféré dans le groupe éclosion assistée contre 10% dans le groupe témoin.
Aucune autre série plus importante n'a été publiée depuis l'obtention de
ces résultats préliminaires.Une étude randomisée en cours dans notre équipe, donne
l'avantage au groupe " hatching " en terme de grossesses
cliniques par transfert. Nous continuons l'étude.
3- Echecs répétés d'implantations
Le tableau 3 montre que seules 2 équipes : OBRUCA et Coll et ANTINORI et Coll
obtiennent des augmentations significatives des taux de grossesses et d'implantation
chez des femmes ayant eu plusieurs transferts d'embryons avec échecs
d'implantation. Ces 2 groupes utilisent le laser pour réaliser l'éclosion
assistée.
4- Eclosion assistée et transferts d'embryons congelés
Seules 2 équipes ont publié des résultats ( tableau 4). CHECK et Coll obtiennent une
différence significative dans les résultats entre le groupe témoin et le groupe
expérimental. Cependant, il est difficile de dire si l'amélioration provient
exclusivement de l'éclosion assistée ou bien si elle provient aussi de la
modification du protocole de congélation - décongélation.
CONCLUSION
L'éclosion assistée a-t-elle un intérêt ?
D'après les études de COHEN et Coll (4) et HELLEBAUT et Coll, l'éclosion
assistée appliquée à une population non sélectionnée n'améliore pas les
résultats de façon significative. Par contre, selon les auteurs ; elle pourrait
avoir un intérêt chez les femmes âgées et/ou à FSH élevée et également chez les
femmes à échecs répétés d'implantation.
Il est difficile de conclure sur l'intérêt de l'éclosion assistée car la
différence de méthodologie entre les équipes rend difficile l'interprétation et
la comparaison des résultats pour plusieurs raisons : différences dans la
sélection des patients, le choix de la technique, le jour de l'éclosion assistée,
le traitement de la phase lutéale (utilisation de corticoïdes et antibiotiques)
Il semble indispensable de faire des études cliniques randomisées avec une
méthodologie comparable à celle des équipes les plus performantes.
Tableau 1 :Résultats d'éclosion assistée pour age
> ou = 39 ans
EQUIPE TECHNIQUE RESULTATS
COHEN et COLL TA(J3) + n=99 16% I/E
1992 Hum . Reprod. n=59 3%I/E
Vol.7, N°5
OLIVENNES et COLL PZD(J2) n=45 cycles 22,2% GT
1994 Contracept 11,1% I/E
Fertil. Sex Vol 22, N° 9
STEIN et COLL PZD(J2) + n=46 23,9% G/P
1995 Fertil. Steril n=43 7 % G/P
Vol 63 pp 838-841
SCHOOLCRAFT TA(J3) + n=38 22% I/E
et COLL 1995 47% Acc/P
J.of . Ass Reprod . And n=28 6% I/E
Gen . Vol 12, N° 9 11% Acc/P
BIDER et Coll, 1997, Hum. TA(J3) n=312 cycles 3,8% BB/T
Reprod. Vol .12,N°2 n=274 cycles 3,3% BB/T
+ : Différence significative entre groupe expérimental et groupe
témoin
TA : Tyrode Acide ;
" PZD " : Dissection Partielle de la ZP,
n : nombre de patients ;
P : Patients, I : Implantation ;
E : Embryon ;
G : Grossesses.
TABLEAU 2 : Essais d'éclosion assistée pour âge > ou =
39 ans
PZD TA
CYCLES 61 122
AGE MOYEN DES FEMMES 40,9 (39-44) 41(39-44)
EMBRYONS TRANSFERES 209(3,5 E/T) 403(3,3 E/T)
GROSSESSES CLINIQUES 11 (18%/T) 15(12,3%/T)
GROSSESSES EVOLUTIVES --- 6 (+2 FCS + 1 GEU)
ACCOUCHEMENTS 7 6
AMP EYLAU
Tableau 3 : Eclosion assistée pour échecs répétés
d'implantation embryonnaire
EQUIPE TECHNIQUE RESULTATS
OBRUCA et COLL Laser (J2) + n= 129 33% G/T
1994 Contracept 14,4% I/E
Fertil . Sex . Vol 22, N° 5
OLIVENNES et SELVA PZD (J2 ou J3) n= 37 24,3% G/T
Contracept . Fertil
Sex. Vol 22,N° 5 12,7% I/E
VEIGA et COLL 1995 TA (J3) n=24 16,7% G/T
Hum. Reprod Vol 10
Supplt 2 6,5% I/E
STEIN et COLL 1995 PZD (J2) n=154 20,8% G/P
Fertil . Steril .
Vol 63 : 838-841 ? % I/E
ANTINORI et COLL 1996 Laser(J2) + n=200 36,4% G/P
Hum . Reprod. Vol 11
N° 3 : 590-594 12,2% I/E
Tableau 4: Eclosion assistée et transferts d'embryons congelés
EQUIPE TECHNIQUE RESULTATS
TUCKER et COLL 1991 PZD (J2) n= 32 cycles 16% I/E
Am.J. Obstet. Gynecol n= 33 cycles 9% I/E
165,341-345
CHECK et Coll,1996 TA (J3) + n=79 15,2 %
G/T
Fertil. Steril. Vol 65, 5,3 % I/E
N°2
. n=79 30,4 % G/T
13,7 % I/E
LISTE BIBLIOGRAPHIQUE
PERONA RM ; WASSARMAN PM. Mouse blastocyst hatch in vitro by using a trrypsin-like
proteinase associated with celles of mural trophectoderm Dev . Biol.
1986 :114 : 42-52
COLE RJ ; Cinemicrographic observations on the trohphoblast and zona pellucida of
the mouse blastocyst. J. Embryol. Exp ; Morphol. 1967 : 17 : 481-490.
GONZALES . DS JONES JM, PINYOPUMMINTR T. , CARNEVALE EM, GINTHER O.J, SHAPIRO SS,
BAVISTER BD, Trophectoderm projections : A potential means for locomotion, attachment
and implantation of bovine, equine and human , blastocysts. Hum.Reprod 1996 : Vol 11,
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COHEN J, ALIKANI M ; TROWBRIDGE J ; ROSENWAKS Z ; Implantation
enhancement by selective assisted hatching using zona drilling of human embryos with poor
prognosis. Hum. Reprod. 1992 :Vol 7,5 : 685- 691
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Micromanipulation of human embryos to assist hatching Fertil . Steril.1994 : Vol
61,3 : 514-520
MANDELBAUM J ; PLACHOT M ; JUNCA AM ; SALAT BAROUX J ;
BELAISCH-ALLART J ; COHEN J Effets d'une dissection partielle de la zona
pellucide (PZD) sur le développement et l'éclosion in vitro d'embryons humains
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HANDYSIDE AH ; KONTOGIAMI EH ; HARDY K ; WINSTON RML ; Pregnancies
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Nature 1990 :344 : 768-770.
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COHEN J ; Assisted hatching : indications and techniques. Acta Europaea
Fertilitatis .1993 : Vol 24, 5 : 215-219
HELLEBAUT.S ; DE SUTTER P ; ONGHENA A ; DOZORTSEV D ; QUIAN
C ; DHONT M . Does assisted hatching improve implantation rates after IVF or
ICSI in all patients : a prospective randomized study. J. Ass . Reprod.
Gen.1996 : Vol 13,1 : 19-22
CECI EST UN NOUVEAU CHAPITRE !!!!
LA FECONDATION ASSISTEE : ICSI
TECHNIQUE DE FECONDATION ET FACTEURS LIMITANTS
LA FECONDATION ASSISTEE : TECHNIQUE DE FECONDATION (ICSI) ET
FACTEURS LIMITANTS
M. DUMONT(1,2), P.COHEN-BACRIE (1), J. TESARIK (1), A. LE MEUR (1), F.X. AUBRIOT(2), S.
DOUARD (2), M. GLISSANT (2), A. HAZOUT (2), A. LAFFY (2). A. STANOVICI (2), M. ADJIMAN
(2), V. IZARD (2).
1-AMP Eylau, 55 rue Saint Didier 75116 PARIS
2-Clinique P. CHEREST, 5 rue P. CHEREST 92200 NEUILLY SUR SEINE
3-Clinique de la MUETTE , 46-48, rue Nicolo 75116 PARIS.
L'ICSI constitue une avancée spectaculaire dans le traitement de la stérilité
masculine. Avec cette technique quelques spermatozoïdes vivants (le plus souvent
mobiles), éjaculés ou prélevés dans le tractus génital de l'homme suffisent pour
réussir à concevoir un enfant.
I . TECHNIQUE D'ICSI
Préparation des ovocytes
Les cellules du cumulus sont dissociées après incubation des ovocytes, pendant 30
secondes à 1 minute, dans du milieu de culture contenant de la hyaluronidase ; Les
cellules périovocytaires sont ensuite retirées par aspiration-refoulement des ovocytes
dans une micropipette en verre de 200 µm de diamètre. Les ovocytes abondamment rincés
dans du milieu de culture sont ensuite observés au microscope inversé pour noter leur
stade de maturation ; puis ils sont incubés en milieu B2 de Ménézo ou milieu BM1
(Ellios-Bio media) pendant 2 à 3 heures dans un incubateur à 37°C, sous atmosphère
humide à 5% de CO2. Seuls les ovocytes en métaphase II seront micro-injectés
Préparation des spermatozoïdes
Les spermatozoïdes utilisés pour l'ICSI ont différentes origines. Ils
proviennent soit d'un éjaculat, soit d'un prélèvement de fluide
épididymaire, soit d'une biopsie testiculaire. Ils peuvent également avoir subi une
cryoconservation avant d'être utilisés.
Spermatozoïdes éjaculés
Après examen au microscope ; tout ou partie du sperme est lavé par
centrifugation à 1800 g pendant 5 minutes avec 5 ml de Earle's ou solution saline de
tyrode puis le culot est déposé sur un gradient discontinu de percoll à 2 couches (45%,
90%) et centrifugé à 400 g pendant 20 minutes. La fraction 90% est ensuite lavée avec 5
ml de Earle's par centrifugation à 1800 g pendant 5 minutes. Le culot de
spermatozoïdes est resuspendu dans du Earle's 3 % BSA ou dans du milieu BM1
et gardé dans l'incubateur à CO2 jusqu'au moment de l'injection
intra-cytoplasmique.
Lorsque le sperme est trop pauvre en spermatozoïdes (cryptozoospermie), un seul lavage
est pratiqué, par centrifugation à 1800 g pendant 5 minutes avec 5 ml de Earle's.
Puis le culot est incubé en Earle's 3% de BSA ou en milieu BM1. C'est
cette même préparation qui est utilisée pour les paillettes de spermes congelés.
-Spermatozoïdes épididymaires
Le fluide épididymaire est dilué dans les milieux B2 ou BM1 et déposé sur un
gradient discontinu de percoll à 3 couches (50% - 70% -90%). Après centrifugation à 400
g pendant 20 minutes les différentes fractions sont lavées avec 4 ml de Earle's par
centrifugation à 400 g pendant 10 minutes. Puis le culot obtenu avec chaque fraction est
dilué avec du Earle's 3% BSA ou du BM1 et incubé à 37°C. Chaque fois que
cela est possible, une partie du sperme est congelée pour des tentatives ultérieures, si
besoin.
Spermatozoïdes testiculaires
La biopsie testiculaire est immergée dans 5 ml de Earle's Hépès ou BM1
puis fragmentée à l'aide de pinces fines. Les différents fragments sont ensuite
écrasés entre deux lames de verre ; La suspension cellulaire est centrifugée à
400 g pendant 10 minutes puis le culot est dilué avec du Earle's 3% BSA et
incubé à 37°C. Avant l'incubation on vérifie, au microscope inversé, qu'il
y a bien présence de spermatozoïdes dans le culot.
Micro-injection intracytoplasmique
Pour la micro-injection, on utilise un équipement spécialisé fixé sur un microscope
inversé. Deux micropipettes sont indispensables pour réaliser l'injection :
une micropipette de contention (diamètre interne : 20 µm) servant à tenir
l'ovocyte et une micropipette d'injection (diamètre interne : 5 µm) pour
prélever le spermatozoïde et l'injecter dans le cytoplasme de l'ovocyte.
Les deux micropipettes sont fixées sur des micromanipulateurs actionnés à distance
par des commandes hydrauliques. Elles sont également reliées à des seringues permettant
d'aspirer ou de refouler l'ovocyte et les spermatozoïdes.
Juste avant la micro-injection, les spermatozoïdes sont placés dans une goutte de
Earle's hépès contenant 10% de polyvinylpyrrolidone (PVP). Le PVP augmente
la viscosité du milieu, ce qui ralentit le mouvement des spermatozoïdes et facilite leur
aspiration dans la pipette d'injection. Chaque ovocyte est déposé dans une goutte
de 5 µl de Earle's hépès ou 5 µl de BM1 autour de la goutte de
spermatozoïdes, le tout étant recouvert d'huile de paraffine légère. La boite de
pétri est ensuite posée sur la platine chauffante du microscope inversé.
Au moment de l'injection ; l'ovocyte est maintenu dans le champ optique
du microscope par une pipette de contention ; de telle sorte que , le globule polaire
soit situé à " midi " ou à " 6 heures " pour
éviter que la pipette d'injection ne touche le fuseau de métaphase II pendant son
introduction dans le cytoplasme de l'ovocyte. Un spermatozoïde préalablement
immobilisé est aspiré dans la pipette d'injection et injecté dans le cytoplasme de
l'ovocyte.
Après la micro-injection, les ovocytes sont réincubés en milieu B2 ou BM1 à 37°C
sous atmosphère humide à 5% de CO2.
Contrôle de la fécondation et transfert embryonnaire
Les pronucléï sont observés 16 à 18 heures après la micro-injection. Le transfert
intra-utérin des embryons a lieu environ 48 heures après la micro-injection.
II . RESULTATS ET DISCUSSION SUR LES LIMITES DE L'ICSI
C'est ainsi que l'injection intra-ovocytaire d'un spermatozoïde
provenant soit de l'éjaculat, soit de l'épididyme, soit du testicule, nous
permet d'obtenir des résultats respectivement égaux à : 62%, 65,6%, 58% pour
le taux de fécondation (2 PN/ovocytes intacts) ; 33,4% ; 39,5% ; 35,8%
pour les taux de grossesses cliniques par transfert (voir tableau 1,2,3,4)
Ces résultats qui corroborent ceux des autres équipes internationales ne doivent
cependant pas faire oublier que pour certaines indications cliniques, des difficultés
subsistent pour produire un embryon viable, par ICSI.
A- FACTEURS SPERMATIQUES LIMITANTS
Parmi ces cas plus difficiles à traiter, il y a :
- les akinétozoospermies
- certaines tératozoospermies
- les azoospermies sécrétoires avec absence de spermatozoïdes testiculaires.
LES AKINETOZOOSPERMIES
La mobilité du spermatozoïde est un facteur prédictif important de la fécondation
par ICSI.
Parmi les akinétozoospermies, il faut distinguer deux groupes :
les akinétozoospermies relatives : aucune mobilité initiale puis obtention
de quelques spermatozoïdes mobiles sur place après préparation et incubation du sperme.
Dans ce cas l'ICSI est réalisable.
Les akinétozoospermies absolues : aucun spermatozoïdes mobiles, même après
incubation. Dans ce cas ; l'injection de spermatozoïdes immobiles ne donne pas
les mêmes résultats selon l'origine des spermatozoïdes. L'étude de NIJS et
Coll, 1996, comparant les résultats de l'ICSI avec spermatozoïdes immobiles
provenant soit de l'éjaculat, soit de l'épididyme, soit du testicule montre
que le taux de fécondation : 53% est significativement moins élevé avec les
spermatozoïdes immobiles de l'éjaculat que dans les deux autres groupes
(épididyme : 60% ; testicule : 65%). Des grossesses évolutives ont été
obtenues seulement dans le groupe avec injection de spermatozoïdes immobiles provenant du
testicule (voir tableau 5).
Le problème majeur avec les akinétozoospermies en ICSI est de distinguer les
spermatozoïdes vivants des spermatozoïdes morts. On peut essayer d'améliorer les
résultats de l'ICSI avec spermatozoïdes immobiles de l'éjaculat en utilisant
le test hypoosmotique (HOS-test : Hypo Osmotic Swelling-Test).Ce test simple permet
de reconnaître les spermatozoïdes vivants qui réagissent à la solution hypoosmotique
par un gonflement et un enroulement du flagelle. L'application de ce test dans huit
cycles d'ICSI par CASPER et Coll, 1996, montre qu'il est possible d'obtenir
un meilleur taux de fécondation (43% contre 26% sans le test) et un meilleur taux de
grossesse ( voir tableau 6).
Nous n'avons pas encore assez de recul pour savoir si l'application de ce
test simple permettra l'obtention d'un pourcentage correct de grossesses
évolutives. Si tel n'est pas le cas ; et pour les spermes ne réagissant pas au
test hypoosmotique, il faudra envisager le recours aux prélèvements de biopsies
testiculaires ; et/ou essayer d'identifier un ou plusieurs facteurs paternels
qui pourraient agir négativement sur le développement embryonnaire (facteurs
génétiques, centriole anormal, anticorps anti spermatozoïdes etc…)
LES TERATOZOOSPERMIES
Le profil des anomalies des spermatozoïdes n'a pas toujours la même valeur. Il
peut comporter une forte prédominance d'une anomalie donnée ou au contraire une
grande diversité d'anomalies. Quand le pourcentage de formes atypiques est
élevé ; le biologiste qui espère toujours pouvoir injecter des spermatozoïdes
paraissant morphologiquement " normaux " se demande quelles sont les
formes anormales qu'il peut injecter sans compromettre la fécondation et le
développement ultérieur de l'embryon ? D'ores et déjà quelques études
permettent de dire qu'il faut éviter d'injecter certaines formes anormales de
spermatozoïdes.
1- Les spermatozoïdes microcéphales
Les patients ayant un syndrome pur de spermatozoïdes microcéphales à tête ronde
(globozoospermie) ont un taux de fécondation réduit ou nulle en ICSI. Malgré cela,
quelques grossesses évolutives ont été obtenues avec ce type de stérilité (tableau7)
. La pratique de l'ICSI dans un système hétérologue homme-souris a permis à
RYBOUCHKIN et Coll, 1996, de mettre en évidence une absence de capacité des
spermatozoïdes microcéphales à activer les ovocytes ; indépendante de la forme et
de la taille exacte du spermatozoïde microcéphale injecté (0% d'activation
ovocytaire contre 95% avec des spermatozoïdes normaux de donneurs) ( tableau 8). Dans
cette même étude l'analyse du caryotype de ces spermatozoïdes montre qu'il ne
présente pas plus d'anomalies (6%) que celui des spermatozoïdes normaux (9%).
L'échec de fécondation chez ce patient pourrait donc être dû à une déficience
en " Oscilline " des spermatozoïdes.
2 Les spermatozoïdes à têtes irrégulières
Il n'y a pas de preuves pour affirmer que les spermatozoïdes anormaux sont
génétiquement anormaux. L'injection de spermatozoïdes humains dans des ovocytes de
souris permet de corréler la morphologie de la tête spermatique avec son contenu
chromosomique.
C'est ainsi que LEE et Coll, 1996, ont montré une augmentation du taux
d'anomalies de structure des chromosomes dans les spermatozoïdes à têtes
allongées ou à contour très irrégulier ( 26,1% d'anomalies contre 6,9% pour les
spermatozoïdes à têtes normales). Cette étude doit être confirmée par des effectifs
plus importants et doit nous inciter à éviter l'injection de ce type de
spermatozoïdes.
LES AZOOSPERMIES SECRETOIRES
En présence d'une azoospermie ; on a recours à un prélèvement
épididymaire ou testiculaire pour obtenir des spermatozoïdes ; Lorsque
l'azoospermie est d'origine sécrétoire ; même si le taux de FSH est
élevé et les testicules petits (moins de 15 ml à l'orchidomètre) ; il est
possible de trouver quelques spermatozoïdes dans les biopsies testiculaires. Néanmoins
dans certaines situations, aucun spermatozoïde n'est visible et la question se pose
de savoir s'il faut rechercher des spermatides (cellules haploïdes précurseurs de
spermatozoïdes) pour réaliser la micro-injection.
On sait que chez l'animal (souris, lapin), l'injection de spermatides
testiculaires fraîches ou congelées a permis la naissance de petits parfaitement normaux
et fertiles (tableau 9).
Dans ces études, il s'agissait d'animaux fertiles alors que chez
l'humain quelques naissances ont été obtenues à partir de spermatides
d'hommes stériles présentant une azoospermie sécrétoire ( tableau 10).
Malgré des résultats obtenus chez les animaux et chez l'homme, montrant que la
procréation avec spermatides fraîches ou congelées est possible ; cette
procréation reste néanmoins peu efficiente.
L'étude de FISHEL et Coll, 1997, (voir tableau 11), comparant les taux de
fécondation entre l'injection de spermatozoïdes et l'injection de spermatides
chez 18 patients OAT sévères ou ayant une azoospermie sécrétoire, ; montre avec
l'injection de spermatides l'obtention de seulement 24 à 30 % de fécondation
contre 67 % avec les spermatozoïdes.
Il faut souligner d'autre part, que les rares succès obtenus chez l'humain
concernent des hommes azoospermes ayant pû prouver dans le passé leur capacité à
produire quelques spermatozoïdes matures ; donc ayant eu une spermatogénèse
complète.
Quand cela est possible ; il semble donc préférable d'injecter des
spermatozoïdes ; en attendant que la recherche progresse pour l'obtention,
d'un meilleur taux de fécondation et de développement embryonnaire avec
l'injection de spermatides.
B- DYSMORPHIES OVOCYTAIRES ET ICSI
Un des grands avantages de l'ICSI, est de pouvoir apprécier non seulement le
stade de maturation nucléaire des ovocytes mais aussi de pouvoir noter leur morphologie
au recueil. La dysmorphie ovocytaire peut se situer à différents niveaux de
l'ovocyte :
- au niveau de la zone pellucide : de forme ou d'épaisseur anormales.
- au niveau du globule polaire : fragmenté ou de taille anormale
- au niveau de l'espace perivitellin : large ou comportant des granulations .
au niveau du cytoplasme avec :
- des vacuoles
- des inclusions denses
- une accumulation de reticulum endoplasmique lisse
- une granularité excessive ou inhomogène.
D'après les travaux publiés sur l'ICSI il semble que le taux de
fécondation des ovocytes dysmorphiques soit semblable à celui des ovocytes normaux
(ALIKANI et Coll ,1995). Néanmoins, une étude plus récente de XIA 1997, montre que les
ovocytes ayant un espace perivitellin normal et un cytoplasme dépourvu d'inclusions
denses ont le taux de fécondation le plus élevé.
Que le taux de fécondation des ovocytes dysmorphiques soit normal ou abaissé, on
s'interroge sur la capacité de ces ovocytes à assurer un développement
embryonnaire normal. En effet, ALIKANI et Coll, 1995, ont montré que plus de grossesses
biochimiques et d'ufs clairs pouvaient être obtenus avec des transferts
d'embryons tous issus, d'ovocytes dysmorphiques, il serait donc intéressant de
pouvoir repérer les dysmorphies ovocytaires responsables de la diminution du potentiel
évolutif des embryons ( MANDELBAUM et Coll, 1997)
Tableau 1
ICSI AVEC SPERMATOZOIDES EJACULES 1993-1996
TABLEAU 2
ICSI AVEC SPERMATOZOIDES EPIDIDYMAIRES 1993-1996
Tableau 3
ICSI AVEC SPERMATOZOIDES TESTICULAIRES FRAIS
1994-1996
Tableau 4
ICSI AVEC SPERMATOZOIDES TESTICULAIRES FRAIS OU CONGELES
(COMPARAISON DES RESULTATS POUR LES 16 PREMIERS COUPLES)
TABLEAU N°5
RESULTATS DE L'ICSI AVEC SPERMATOZOIDES IMMOBILES
Origine des spermatozoïdes
|
EJACULAT |
EPIDIDYMAIRE |
TESTICULE |
n patients |
12 |
3 |
26 |
Taux de fécondation |
53 |
60 |
65 |
Grossesses / Transfert |
1/12 |
0/3 |
8/26 |
Grossesses évolutives |
0 |
- |
5 (19%) |
D'après NIJS et Coll , 1996
Hum. Reprod. Vol 11, N° 10
TABLEAU 6
RESULTATS DE L'ICSI AVEC SPERMATOZOIDES IMMOBILES ET UTILISATION DU HOS-TEST
|
8 Cycles sans HOS-TEST
|
8 Cycles avec
HOS-TEST |
Taux de Fécondation |
26% (25/96)- |
43% (31/72) |
Embryons de bonne
qualité |
54,6% |
56,2% |
Transferts (T ³ 3 E ) |
8 (3) |
8 (6) |
Grossesses cliniques |
0 |
3
1 accouchement de jumeaux
1 FCS à 14 semaines
1 FCS à 8 semaines |
D'après CASPER et Coll, 1996
Fertil. Steril. Vol. 65, N° 5
TABLEAU 7
RESULTATS DE L'ICSI AVEC LES SPERMATOZOIDES A TETES RONDES
|
n patients |
Taux de Fécondation |
Grossesses |
LUNDIN et Coll 1994 Fertil . Steril.
Vol 62 ,N°6 |
1 |
12/28 |
1 Gemellaire
( 1 fille + 1 garçon) |
BOURNE et Coll, 1995 Fertil. Steril. Vol
63,N°6 |
1 |
3/8 |
- |
LIU et Coll, 1995 Hum. Reprod. Vol 10,N°3 |
7
(11 Cycles) |
14/85 |
1 FCS
3 1 GEU
1 Gemellaire |
TROKOUDES et Coll, 1995, Hum. Reprod. Vol
10, N°4 |
1 |
3/6 |
1 ( Fille ) |
TABLEAU 8
INJECTION DE SPERMATOZOIDES HUMAINS DANS DES OVOCYTES DE SOURIS
( Comparaison entre spermatozoïdes normaux et spermatozoïdes à têtes rondes)
Ovocytes injectés
Ovocytes intacts
Ovocytes activés |
Spermatozoïdes de donneur |
Spermatozoïdes à tête ronde |
|
|
- Activation ovocytaire |
+ Activation ovocytaire |
|
75 61
58 (95%) |
118 88
0 |
130 97
93 (96%) |
D'après RYBOUCHKIN et Coll, 1996
Hum. Reprod. Vol. 11,N°10
TABLEAU 9
RESULTATS DES INJECTIONS DE SPERMATIDES CHEZ L'ANIMAL
Espèce |
Technique |
Embryons transférés |
Naissances |
Références |
Souris |
Electrofusion |
346 |
4 |
- OGURA et Coll , 1994
Pro. Natl. Acad. Sci. USA,91 ,7460 |
Lapin |
Injection de noyau |
121 |
3 |
NV. SOFIKITIS et Coll,1994. J. Assist.
Reprod.Genet . Vol11,335 |
Souris |
Injection de noyau + cytoplasme |
131 |
35 |
Y.KIMURA et Coll,1995, Development.121,2397 |
Lapin |
Injection de noyau |
150 |
14 |
NV.SOFIKITIS et Coll,1996 Fertil. Steril.
Vol 65,176 |
Souris |
Injection noyau + Cytoplasme Spermatide
congelée |
150 |
17 |
A.OGURA et Coll,1996, J.of Assist. Reprod
and Genetic. Vol 13,N°5 |
Tableau 10
RESULTATS DES INJECTIONS DE SPERMATIDES CHEZ L'HUMAIN
Type de spermatides |
Sources |
Injection |
Embryons |
Grossesses |
Naissances |
Références |
Allongées |
Testicules |
Cellules entières |
1 |
0 |
0 |
P.VANDERZWALMEN et Coll,1995 Hum. Reprod.
.Vol 10,502 |
Rondes |
Testicules |
Noyaux |
? |
4 |
0 |
T.HANNAY,1995 |
Rondes |
Ejaculat |
Cellules entières |
14 |
2 |
2 |
J.TESARIK et Coll,1995,1996 |
Allongées |
Testicules |
Cellules entières |
1 |
1 |
1 |
S.FISHEL et Coll,1995,1996 |
Allongées |
Ejaculat |
Cellules entières |
11 |
0 |
0 |
J.TESARIK et Coll,1996 |
Rondes. Allongées |
Testicules |
Cellules entières |
56 55 |
2 3 (1FCS) |
? ? |
S.ANTINORI et Coll,1997 Hum. Reprod. Vol
12,N°2 |
Rondes Congelées |
Testicules |
Cellules entières |
6 |
1 (16 semaines) |
? |
S.ANTINORI et Coll,1997 Hum. Reprod. Vol
12,N°3 |
- Rondes - Allongées ou en cours
d'allongement |
Testicules |
Cellules entières |
49 23 |
1 4 (1FCS + 1 G. evol.) |
1 2 |
P.VANDERZWALMEN et Coll,1997. Hum. Reprod.Vol
12,N°6 |
Tableau 11
COMPARAISON DES TAUX DE FECONDATION OBTENUS PAR INJECTION
DE SPERMATOZOÏDES OU DE SPERMATIDES RONDES OU ALLONGEES
(18 PATIENTS)
Cellule Injectée |
Source
des Gamètes
Ejaculat Testicules |
Total |
Spermatide ronde Spermatide
allongée
Spermatozoïdes |
33 18
63 |
21 38
74 |
30% 24%
67% |
D'après S. FISHEL et Coll, 1997
Hum. Reprod. Vol 12, N°2
BIBLIOGRAPHIE
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injection of spermatid. Lancet, 1995 : 345, 1641-1642
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early, or a time too soon ? Hum. Reprod, 1996 : Vol 11, N°7 pp 336-340
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Sex, 1997 : Vol 25, N°7,pp 607-610.
- SOFIKITIS. NV , TODA. T. MIYAGAWA. I , ZAVOS. PM Beneficial effects
of electrical stimulation before round spermatid nuclei injections into rabbit
oocytes on fertilization and subsequent embryonic development. Fertil. Steril,
1996 : Vol 65, N° 1, pp 176-185
- SOFIKITIS. NV, MIYAGAWA. I, AGAPITOS. E, PASYIANOS. P, TODA. T, HELLSTROM.
WJ, KAWAMURA. H. Reproductive capacity of the nucleus of the male gamete after
completion of meiosis. J. Assist. Reprod. Genet, 1994 Aug, 11(7) : 335-41
- TESARIK. J, MENDOZA. C, TESTART. J Viable embryos from injection of
round spermatids into oocytes. N. Engl. J.Med, 1995 : 333,525
- TESARIK.J, ROLET. F, BRAMI. C, SEDBON. E, THOREL. J, TIBI. C, THEBAULT.
A, Spermatid injection into human oocytes. II Clinical application in the
treatment of infertility due to non obstructive azoospermia. Hum. Reprod,
1996 Vol 11, N°4, pp 780-783
- XIA.P,Intracytoplasmic sperm injection : correlation of oocyte grade
based on polar body , perivitelline space and cytoplasmic inclusions with
fertilization rate and embro quality. Hum. Reprod, 1997 : Vol 12, N°
8, pp 1750-1755.
2. Questions QCM ICSI
- Akinétozoospermie avec 30% de vitalité
- ICSI directe
- Test hypoosmotique et ICSI
- ICSI avec spermatozoïdes de biopsie testiculaire
2- Obtention de 800 000 spermatozoïdes mobiles après migration avec 80% de
formes atypiques
a IAC
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- ICSI
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