Stéphane Viville

Service de Biologie de la Reproduction SIHCUS-CMCO, 19, rue Louis Pasteur BP120, 67303 Schiltigheim - France

Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, CNRS/INSERM/ULP, 1, rue Laurent Fries, BP 163, 67404 Illkirch Cedex, C.U. de Strasbourg, France

Le diagnostic pré-implantatoire (DPI) est né de la pratique de la fécondation in vitro (FIV) et du développement des techniques de biologie moléculaire permettant une analyse génétique sur cellule unique. La première FIV date de 1978 et est de pratique courante depuis le milieu des années 80. Les techniques de biologie moléculaire sont encore plus récentes, la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) date de 1987 et l'hybridation in situ avec des sondes fluorescentes (FISH) du début des années 90 .
Le DPI moléculaire par PCR permet d'identifier des mutations, elle est utilisée aussi bien pour des pathologies récessives que dominantes. Les difficultés proviennent du peu de matériel biologique disponible, une seule cellule. En effet, lors d’une PCR classique, il est utilisé généralement entre 100 et 500ng d’ADN génomique, soit l’équivalent de 20 000 à 100 000 cellules ! Chaque test PCR devra donc être optimisé de façon à pouvoir obtenir le niveau de sensibilité requis. La fiabilité du test sera évaluée sur de nombreuses cellules uniques (lymphocytes, lymphoblastes ou blastomères). De plus, dans les protocoles actuellement utilisés la PCR ne permet la détection que d’une seule mutation, au mieux deux à la fois. Ceci signifie que lorsqu'un diagnostic est disponible, il l'est pour une des mutations responsables du syndrome et non pour la maladie. Sachant que de multiples mutations peuvent êtres responsables d'un même syndrome (plus de 800 dans le cas de la mucoviscidose) et qu'il faut de 6 mois à 1 an de mise au point pour chaque diagnostic, on comprend mieux pourquoi si peu de diagnostics sont disponibles. Enfin, il existe un risque de contamination de l’échantillon pouvant engendrer une erreur diagnostique. Pour éviter ces problèmes, il est impératif d’adopter des conditions de travail draconiennes. En effet, de multiples sources de contamination peuvent affecter le résultat d'un DPI. Elles peuvent provenir de cellules du manipulateur, de cellules de la corona radiata entourant l'embryon, de spermatozoïdes prisonniers de la zone pellucide ou, et cela représente la source principale, de produits d'amplifications antérieures pouvant rester sous forme d'aérosol dans le laboratoire. Afin de minimiser ce problème, le prélèvement, le transfert de la cellule ainsi que la préparation des solutions de PCR doivent se faire dans un laboratoire "propre" dédié au travail sur cellule unique et isolé du laboratoire d’analyse des produits d’amplification. Nous travaillons en tenue stérile sous hotte à flux laminaire et dans une pièce réservée à cet effet. Cette pièce est en surpression et équipée de lampes UV. Le peu de temps imparti à la réalisation du DPI limite aussi les possibilités de diagnostic. L'ensemble du diagnostic doit être fait dans la journée du troisième jour après la fécondation. Enfin une dernière difficulté se présente quand il s’agit, à partir d’une seule cellule, d’amplifier deux allèles différents (cellule hétérozygote).En effet, dans un nombre de cas variable selon le test utilisé (de 5 a 25 %) un seul allèle est amplifié (phénomène d'allèle drop out (ADO)) ce qui peut fausser le résultat du diagnostic.
Grâce à la PCR, le DPI est maintenant possible pour des maladies génétiques comme la mucoviscidose, le syndrome de l'X fragile, l’amyotrophie spinale, certaines thalassémies, le syndrome de Steinert ou le syndrome de Lesch-Nyhan. Pour des maladies très hétérogènes comme la mucoviscidose ou les thalassémies, les progrès viendront de la possibilité de réaliser des diagnostics indirects par étude de marqueurs polymorphes . Cette solution permettra d’identifier non plus une mutation mais l’allèle ou les allèles pathogènes. De tels protocoles, basés sur un test multiplex sur cellule unique, pourraient ensuite être proposés à tous les patients pour lesquels on aurait pu dégager une informativité. Ce procédé permet d’éviter la mise au point de tests PCR sur cellule unique pour chaque mutation familiale. De surcroît, l’étude en multiplex de marqueurs informatifs peut permettre de détecter une éventuelle contamination par des cellules étrangères et de détecter les cas d’ADO.