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Titre: Techniques et résultats de l'exploration de la fonction acrosomique
Année: 1994
Auteurs: - Parinaud J.
Spécialité: Infertilité
Theme: Infertilité masculine

TECHNIQUES ET RESULTATS DE L'EXPLORATION DE LA FONCTION ACROSOMIQUE

Jean PARINAUD, Bénédicte LABAL, Gérard VIEITEZ, Gérard RICHOILLEY

Laboratoire de Fécondation In Vitro

CHU La Grave, Toulouse

 

L'acrosome, vésicule d'origine golgienne, joue un rôle essentiel dans les processus de fécondation tant in vivo qu'in vitro (1-3). En effet, les enzymes qu'il contient (hyaluronidase, acrosine) permettent au spermatozoïde de franchir les enveloppes de l'oeuf (cumulus oophorus, zone pellucide). Pour utiliser ces enzymes, le spermatozoïde doit effectuer la réaction acrosomique. Celle-ci consiste en une fusion de la membrane plasmique avec la membrane acrosomique externe, entraînant la formation de vésicules membranaires et la libération du contenu acrosomique. En fin de réaction acrosomique, le spermatozoïde a donc perdu son acrosome et n'est plus recouvert, au niveau du sommet de la tête, que par la membrane acrosomique interne.

La réaction acrosomique, déclenchée par une entrée de calcium dans la cellule, nécessite la capacitation préalable des spermatozoïdes et est physiologiquement induite par la fixation sur la zone pellucide (4-5). De plus, outre son rôle dans la pénétration du spermatozoïde dans l'espace péri-vitellin, elle est nécessaire à la fusion avec la membrane ovocytaire (6).

L'étude de la fonction acrosomique est donc d'un grand intérêt dans l'évaluation de la fertilté masculine. C'est ainsi que de nombreuses techniques se sont récemment développées. Ces différentes méthodes n'explorent pas exactement les mêmes aspects de l'acrosome et de la réaction acrosomique, et le but de cet étude était de les comparer sur les mêmes échantillons de sperme afin d'essayer de mieux les codifier.

 

1 Techniques d'étude de l'acrosome

1-1 Morphologie en microscopie optique

Si la microscopie optique après coloration (spermocytogramme) ne permet pas de visualiser avec précision l'acrosome, elle donne une approche grossière de sa morphologie en appréciant le pourcentage d'acrosomes malformés ou absents (7).

1-2 Morphologie en microscopie électronique

La microscopie électronique est le seul moyen de visualiser directement et de façon fiable l'acrosome, ce qui en fait la technique de référence (8). Toutefois, la lourdeur de sa mise en oeuvre empêche son utilisation en pratique courante; de plus, elle ne permet pas d'explorer en même temps la vitalité des spermatozoïdes.

1-3 Marquage de la membrane acrosomique externe

La membrane acrosomique externe peut être visualisée par l'utilisation de lectine d'Arachis hypogea (PNA) marquée à la fluorescéine (9). Les spermatozoïdes intact ont un acrosome globalement fluorescent, alors que les spermatozoïdes ayant perdu leur acrosome ("réactés") ne sont plus fluorescents ou ne possédent qu'une bande équatoriale fluorescente. Conjuguée à l'utilisation d'un marqueur supra-vital fluorescent (Hoechst 33258, homodimère d'ethidium), cette technique permet de classer les spermatozoïdes en: vivants non réactés, vivants réactés, morts non réactés et morts réactés. Cette méthode demande une fixation et une perméabilisation des membranes du spermatozoïde.

1-4 Marquage du contenu acrosomique

Le contenu acrosomique peut être marqué par le rose bengal (triple coloration de Talbot) (10) ou par la lectine de Pivum sativum (PSA) marquée à la fluorescéine (11-12). La perte du marquage signe ici aussi la réaction acrosomique. Ces techniques sont également couplées à l'utilisation de marqueurs supra-vitaux et requièrent la perméabilisation des membranes.

 

1-5 Marquage de la membrane acrosomique interne

Dans ce cas, la membrane acrosomique interne est révélée par l'utilisation de concanavaline A marquée à la fluorescéine (13) ou par un anticorps monoclonal GB24 (14) ou MH61 (15). La fixation de ces anticorps peut être mise en évidence par l'utilisation soit d'immunobilles (15) soit d'une antiglobuline fluorescente (14). Ces techniques ne nécessitent pas de perméabilisation des membranes et ici la réaction acrosomique se traduit par l'acquisition d'un signal (fluorescence ou fixation des immunobilles) et non par sa perte comme pour les techniques précédentes. Elles peuvent également être couplées avec un marqueur de vitalité.

1-6 Mesure de l'acrosine

Elle fait appel à des techniques enzymatiques; elle donne de faibles corrélations avec la clinique et n'explore que l'aspect quantitatif du contenu acrosomique et non l'aspect fonctionnel de l'acrosome (16-17).

1-7 Test de pénétration dans l'ovocyte dépellucidé de hamster

Il ne s'agit pas à proprement parler d'une évaluation de la fonction acrosomique mais d'une exploration de la capacité fusionnelle des spermatozoïdes. Toutefois, la réaction acrosomique étant indispensable à la fusion membranaire, il existe une bonne corrélation entre la fonction acrosomique et les résultats du test de hamster (18-19). La lourdeur de cette méthode ne permet pas son application en routine et elle est donc réservée à des protocoles de recherche clinique.

 

2 Inducteurs de la réaction acrosomique in vitro

Le stimulus physiologique de la réaction acrosomique, la zone pellucide, n'étant pas utilisable en pratique courante, d'autres inducteurs sont utilisés pour évaluer la capacité des spermatozoïdes à faire leur réaction acrosomique.

2-1 Calcium ionophore

Il s'agit d'un agent pharmacologique permettant de faire entrer dans les cellules de fortes concentrations de calcium. Si son mécanisme d'action n'est pas du tout physiologique, il permet d'explorer la cascade des évènements amenant à la réaction acrosomique après l'entrée de calcium. Le calcium ionophore est le plus puissant inducteur de la réaction acrosomique (20-21) et Fénichel et al. (22) ont pu montrer que la réponse qu'il induit donne de bonnes corrélations avec la clinique.

2-2 Liquide folliculaire

Le liquide folliculaire est un inducteur plus physiologique mais moins puissant que le calcium ionophore (8, 23-24). Son action est liée à son contenu en progestérone (24) et l'efficacité varie beaucoup d'un échantillon à l'autre (25), ce qui nécessite l'utilisation de pools pour diminuer les variations inter-essais.

2-3 Progestérone

La progestérone, molécule responsable de l'activité inductrice du liquide folliculaire, agit par l'intermédiaire de récepteurs membranaires (26). Sa fixation sur la membrane du spermatozoïde entraîne une entrée de calcium (27). Toutefois, elle n'induit la réaction acrosomique qu'à de très fortes concentrations (28). Enfin, Tesarik et al. (29) ont montré que dans les infertilités masculines les spermatozoïdes pouvaient avoir un déficit en récepteurs pour la progestérone.

 

3 Comparaison des techniques et applications cliniques en FIV (30)

Cette étude a porté sur 53 spermes utilisés en vue de Fécondation In Vitro. Selon les critères de l'OMS (31), 19 étaient normaux (numération: 157 ± 28x106/ml; mobilité: 50 ± 2%) et 34 anormaux (numération: 43 ± 10x106/ml; mobilité: 29 ± 3%). Parmi les normaux, 18 (95%) ont fécondé, alors que seulement 12 anormaux (26%) ont permis d'obtenir des embryons.

3-1 Résultats de l'étude morphologique

L'étude morphologique a été effectuée après coloration avec le colorant de Schorr et les acrosomes ont été classés selon Adelman et Cahill (7).

 

Tableau 1: Influence du taux d'anomalies de l'acrosome sur les résultats de la FIV

Résultats de la FIV

Echecs (23)

Succès (30)

Comparaison statistique

Acrosomes anormaux (%)

38 ± 4

22 ± 3

p < 0,01a

% acrosomes anormaux

< 30%

³ 30%

7

15

24

6

 

 

p < 0,01b

Moyenne ± écart à la moyenne.

a Mann-Whitney; b Chi2

Le tableau 1 montre que le pourcentage d'acrosomes malformés ou absents est significativement supérieur dans les cas d'échecs de fécondation. De plus, les chances de fécondation sont de 77% si il y a moins de 30% d'anomalies de l'acrosome et seulement de 29% si plus de 30% des spermatozoïdes ont un acrosome malformé (p < 0,01).

3-2 Comparaison PNA-GB24

Nous avons comparé, sur les mêmes échantillons de sperme, deux techniques différentes d'étude de la réaction acrosomique: l'une utilisant le marquage de la membrane externe de l'acrosome par la PNA, l'autre le marquage de la membrane interne par l'anticorps GB24 (Théramex, Monaco). Dans les deux cas, la vitalité était étudiée en utilisant le Hoechst 33258. La technique de PNA visualise la réaction acrosomique par une perte de signal, alors que celle utilisant le GB24 la visualise par une acquisition de signal.

Les résultats obtenus montrent que le taux de spermatozoïdes spontanément réactés est plus élevé avec la PNA qu'avec le GB24 (19 ± 2% versus 11± 1%; p < 0,001). Par contre, lorsque l'on évalue le pourcentage de réaction acrosomique induit par le calcium ionophore (20µM, 30mn), les deux techniques donnent les mêmes résultats (43 ± 2%pour PNA versus 40 ± 2% pour GB24; NS).

 

Tableau 2. Comparaison PNA-GB24 en fonction de la qualité du sperme

Qualité du sperme

Normale (19)

Anormale (34)

Réaction acrosomique spontanée

PNA (%)

GB24 (%)

D PNA-GB24 (%)a

14 ± 2

10 ± 1

4 ± 2c

22 ± 2b

12 ± 1

10± 2

Moyenne ± écart à la moyenne.

a Différence entre PNA et GB24

b p < 0,001 versus GB24 (test de Wilcoxon)

c p < 0,05 versus spermes anormaux (Test de Mann-Whitney)

Le tableau 2 montre que les deux techniques ne donnent des résultats différents que dans les spermes anormaux. La différence entre les deux méthodes (D PNA-GB24) n'est pas corrélée au pourcentage d'anomalies de l'acrosome (r = 0,28; NS).

Tableau 3. Comparaison PNA-GB24 en fonction du résultat de la FIV

Résultat de la FIV

Echecs (23)

Succès (30)

Réaction acrosomique spontanée

PNA (%)

GB24 (%)

D PNA-GB24 (%)a

22 ± 3b

11± 2

11± 2c

16 ± 1

12 ± 1

4 ± 1

Moyenne ± écart à la moyenne.

a Différence entre PNA et GB24

b p < 0,05 versus GB24 (test de Wilcoxon)

c p < 0,05 versus succés (test de Mann-Whitney)

Le tableau 3 montre que la différence entre PNA et GB24 n'est significative que dans les échecs de fécondation et que le DPNA-GB24 est significativement plus élevé dans les échecs que dans les succès. De plus, si le DPNA-GB24 est supérieur à 14%, le pourcentage de succès n'est que de 14% contre 70% s'il est inférieur ou égal à 14% (p < 0,05).

Lorsque l'on considère uniquement les spermes anormaux, ceux qui fécondent ont un DPNA-GB24 inférieur à ceux qui ne fécondent pas (6 ± 1% versus 12 ± 2%; p < 0,05), malgré des numérations et des mobilités identiques.

3-2 Comparaison des inducteurs (calcium ionophore, liquide folliculaire, progestérone)

Nous avons comparé, lors de la même étude, les résultats de l'induction de la réaction acrosomique par le calcium ionophore A23187 (20µM, 30mn), la progestérone (1mM, 6h) et le liquide folliculaire (20%, 6h).

Tableau 4. Comparaison des inducteurs de la réaction acrosomique en fonction des résultats de la FIV

Résultats de la FIV

Echecs (23)

Succès (30)

Induction par le A23187

34 ± 4 a

45 ± 2

Induction par le liquide folliculaire

2,6 ± 0,9

1 ± 0,6

Induction par la progestérone

3,7 ± 1,1

3,1 ± 0,6

Moyenne ± écart à la moyenne

a p < 0,01 versus succès (test de Mann-Whitney)

Les résultats rapportés au tableau 4 montrent que la seule différence significative entre échecs et succès de fécondation concerne l'induction par le calcium ionophore. De plus, lorsque le pourcentage de réaction acrosomique induite est inférieur à 35%, le taux de succès est significativement abaissé (20% versus 71%; p < 0,01).

Lorsque l'on considère uniquement les spermes anormaux, ceux qui fécondent ont une réponse au A23187 supérieure à ceux qui ne fécondent pas (52 ± 4% versus 35 ± 4%; p < 0,05), malgré des numérations et des mobilités identiques.

 

Si l'on prend en compte les trois aspects de la fonction acrosomique (morphologie, DPNA-GB24, réponse au A23187), on peut déterminer deux groupes différant par leurs chances de succès en FIV (21% versus 80%; p < 0,001). De même, si l'on considère uniquement les spermes anormaux, on peut séparer deux populations, ayant des caractéristiques conventionnelles similaires (numération, mobilité): l'une ayant 17% de chances de succès, l'autre en ayant 60% (p < 0,05).

4 Discussion

Cette étude confirme l'intérêt clinique de l'étude de la fonction acrosomique mais souligne les difficultés méthodologiques rencontrées.

L'étude de la morphologie de l'acrosome lors du spermocytogramme, bien que relativement grossière, garde tout son intérêt. Toutefois, il s'agit d'une analyse partiellement subjective et peu reproductible d'un opérateur à l'autre. De plus, elle ne permet pas d'évaluer la capacité des spermatozoïdes à réagir.

Si la PNA et le GB24 donnent les mêmes résultats dans la réaction induite, la PNA surestime le pourcentage de spermatozoïdes spontanément réactés. Ces données suggérent que si les deux méthodes sont également efficaces dans l'évaluation de la véritable réaction acrosomique, la PNA considére comme réactés des spermatozoïdes qui ont en réalité un acrosome déficient. En effet, contrairement au GB24 qui marque la membrane acrosomique interne et qui donc ne se fixe que sur les spermatozoïdes qui ont découvert celle-ci lors de leur réaction acrosomique, la PNA marque l'acrosome et la réaction acrosomique se traduit par une perte de signal. On peut ainsi considérer que des spermatozoïdes ayant un défaut de l'acrosome ne sont pas marqués par la PNA sans avoir réagi pour autant. Le DPNA-GB24 permet d'évaluer le pourcentage de ces spermatozoïdes porteurs d'un défaut du contenu acrosomique. Cet aspect de l'évaluation de l'acrosome est différent de la morphologie étudiée par le spermocytogramme puisque nous n'avons trouvé aucune corrélation entre les deux (r = 0,28; NS).

Parmi les inducteurs étudiés, seul le calcium ionophore permet de discriminer les échecs des succés. Il s'agit d'un autre abord de la fonction acrosomique puisque les résultats de l'induction par le calcium ionophore ne corrèlent ni avec la morphologie (r = -0,07; NS) ni avec le DPNA-GB24 (r = 0,16; NS). C'est l'aspect fonctionnel de l'acrosome, sa capacité à faire sa réaction acrosomique qui est ici étudiée. Ces résultats sont tout à fait en accord avec ceux précedemment rapportés par d'autres auteurs (22, 32). Dans notre étude, nous n'avons pas trouvé de valeur discriminante de l'induction par le liquide folliculaire ou la progestérone. Toutefois, il faut remarquer que, dans la population étudiée, le taux de réaction acrosomique induite par ces deux substances est faible, ce qui peut masquer en partie une valeur discriminante.

Au total, l'étude de la fonction acrosomique peut se faire selon 3 modalités complémentaires: la morphologie par le spermocytogramme, la qualité du contenu acrosomique par le DPNA-GB24 et la capacité à réagir par la réponse au calcium ionophore. Il faut souligner que ces trois éléments permettent de discriminer efficacement échecs et succès quels que soient les caractéristiques conventionnelles du sperme (numération, mobilité). Il s'agit donc d'un abord différent et complémentaire de la fécondabilité du sperme. Si cette exploration est d'un intérêt clinique certain, pouvant amener dans l'avenir à une meilleure adéquation des choix thérapeutiques (FIV ou micro-injection), ses modalités restent à codifier. De plus, les études effectuées portent sur des populations restreintes ce qui ne permet pas actuellement de déterminer des normes précises et donc des seuils de pathologie.

 

 

Remerciements: Les auteurs remercient Mademoiselle Hélène Moutaffian (Théramex, Monaco) pour leur avoir procuré l'anticorps GB24.

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