les fécondations assistées en question

I - Introduction

Environ 15 % des couples français ont des problèmes de fertilité dont la moitié sont d'origine ou de participation masculines.

En 1994, 45,3 % des ponctions pour fécondation in vitro (FIV) en France ont été pratiqués en raison d'une indication masculine pure ou associée à une anomalie tubaire avec un taux de grossesses cliniques par ponction de 15,2 % en cas de stérilité masculine isolée et de 20 % en cas de stérilité tubaire isolée. La différence, statistiquement significative, témoigne des limites de la FIV conventionnelle à traiter les déficiences spermatiques quantitatives ou qualitatives dont certaines sont même trop sévères pour accéder à ce type de thérapeutique.

Il y eut de nombreuses tentatives d'améliorer la mobilité des spermatozoïdes in vitro avec des succès relatifs, soit en isolant la fraction la plus mobile (gradient de percoll...), soit en utilisant des activateurs du mouvement d'origine biologique (sérum, fluide folliculaire...) ou pharmacologique (caféine, 2-déoxyadénosine, pentoxifylline ...).

Régulièrement sont publiés des procédés d'insémination (IA) censés augmenter la fécondance en cas de tératospermies majeures (fortes concentrations de spermatozoïdes) ou destinés à augmenter les chances de collision des gamètes en cas d'OATS sévères ( fécondation en microgouttes).

Depuis 1990, se sont développées des techniques plus offensives, dites de " fécondation assistée ", visant à court-circuiter les dernières barrières séparant le gamète mâle du cytoplasme ovocytaire.

II - Quelle technique de microinjection choisir ?

Trois techniques se sont succédées et ont connu une période de gloire plus ou moins brève [1].

1 - Zona Drilling (ZD) et Partial Zona Dissection (PZD)

Elles comportent la réalisation d'une brèche chimique (ZD) ou mécanique (PZD) dans la zone pellucide.

Des études expérimentales chez la souris avaient clairement démontré qu'en pratiquant une brèche dans la zone pellucide (ZP), il était possible d'obtenir des fécondations avec des concentrations en spermatozoïdes 100 fois inférieures à celles nécessaires face à un ovocyte intact. L'orifice était créé par digestion localisée de la ZP à l'aide de Tyrode acide (pH : 2.3) appliqué grâce à une micropipette. Les spermatozoïdes mobiles dans le milieu d'insémination étaient alors capables d'accéder facilement par la brèche à l'espace périvitellin, comme le prouvait l'obtention de fécondations même en présence d'anticorps anti ZP3 empêchant toute fécondation normale par fixation à la ZP et pénétration.

De cette propriété découlent les inconvénients majeurs de la méthode qui nécessite donc la présence d'un nombre suffisant de spermatozoïdes mobiles et de bonne motilité et qui supprime la prévention efficace de la polyspermie au niveau de la ZP.

Il en est de même pour la technique d'ouverture mécanique de la ZP décrite par Malter et Cohen ou PZD [2] qui consiste à embrocher tangentiellement la zone pellucide de l'ovocyte maintenu par la pipette de contention, en passant, dans l'espace périvitellin (EPV), à distance de la membrane plasmique et à abraser la portion de zona sus-jacente à la pipette de perforation par frottement répété contre la pipette de maintien. L'orifice ainsi créé est de taille variable et s'il facilite l'accès de l'EPV aux spermatozoïdes, ce n'est que dans 49 % des cas tandis que 51 % des ovocytes traités ne présentent aucun spermatozoïde sous la ZP, la brèche s'étant sans doute rapidement collabée.

Pour pallier cette variabilité de taille de la brèche certains ont proposé et utilisé le laser qui permet effectivement de réaliser des orifices de calibre régulier et déterminé mais reste d'un coût prohibitif.

De toute façon, plusieurs études ne retrouvent aucune augmentation significative des taux de fécondation diploïde après PZD comparativement à la FIV classique (Tableau I) ; seules les formes les moins sévères d'OATS peuvent être traitées et le taux de grossesse clinique par cycle ne dépasse pas 5 % en moyenne.

La PZD a, de ce fait , été pratiquement abandonnée dans les indications masculines.

2 - L'insémination sous-zonale ou SUZI (subzonal insemination)

Tentée pour la première fois en 1987 [3-4] l'injection d'un ou plusieurs spermatozoïdes sous la zone pellucide semblait pouvoir réunir plusieurs avantages : permettre à des spermatozoïdes peu ou pas mobiles de réaliser la fusion, favoriser le contrôle du nombre de spermatozoïdes déposés dans l'EPV et le choix des spermatozoïdes prélevés par l'opérateur en écartant dans la mesure du possible les gamètes porteurs d'anomalies morphologiquement visibles, réaliser une brèche de très petite taille peu traumatisante et enfin conserver une barrière de sélection naturelle, la membrane plasmique ovocytaire.

Il ne restait plus au(x) spermatozoïde(s) qu'à réaliser la fusion et, la décondensation de leur noyau. Un peu plus performant que la PZD, le SUZI a permis d'obtenir des taux de fécondation significativement plus élevés que la FIV conventionnelle (Tableau II) mais qui restent trop modestes (18 %) et de façon concordante pour tous les auteurs. Les taux de grossesse de10 % par cycle en moyenne entrainaient la déception vis-à-vis d'une technique lourde et qui n'est restée comme la qualifiait S. Fishel " qu'une lueur d'espoir " [5].

3 - L'injection intracytoplasmique :ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection)

Il avait été montré chez le hamster, le rat, la souris, le lapin et l'humain qu'un spermatozoïde introduit dans le cytoplasme ovocytaire à l'aide d'une micropipette était capable de former le pronucleus mâle. Cependant, le pourcentage de fécondation restait faible et le taux d'ovocytes lésés par la micro-injection élevé, de l'ordre de 40 %.Il semble que la première grossesse obtenue après injection d'un spermatozoïde dans l'ovocyte l'ait été chez les bovins, mais c'est finalement chez l'humain que l'ICSI allait connaître un essor considérable et la survenue, en 1992, des premières grossesses [6].Utilisant pour réaliser le SUZI, des pipettes d'injection à pointe effilée ou " spike ", Palermo, chercheur de l'équipe bruxelloise des Pr Devroey et Van Steirteghem eut le désagrément de perforer le cytoplasme d'un certain nombre d'ovocytes et la surprise de constater que ces ovocytes étaient fécondés plus souvent que ceux microinjectés sous la ZP et que 20 % d'entre eux seulement étaient lésés par l'ICSI. Depuis, la technique s'est révélée particulièrement perfomante.

Elle consiste, comme pour les autres méthodes de microinjection, à tout d'abord préparer les ovocytes : dénudage par brève exposition à la hyaluronidase puis pipetage répété à travers une pipette effilée. L'ovocyte ainsi débarrassé des cellules du cumulus et de la corona est maintenu par la pipette de contention (diamètre interne 20 µm, externe 80 à 100 µm) de façon à ce que le globule polaire, témoin de maturité nucléaire, soit positionné à 0h ou 6h.Le sperme est préparé classiquement (lavage-centrifugation, gradient de Percoll) et les spermatozoïdes mobiles sont immobilisés mécaniquement dans une solution de polyvinylpyrrolidone (PVP) à 10 % avant d'être aspirés individuellement à l'aide d'une micropipette d'injection (diamètre externe : 7 µm, diamètre interne : 5 µm) et positionnés à son extrémité.

Après avoir traversé la ZP, l'EPV et l'oolemme, une aspiration du cytoplasme dans la micropipette assure la rupture franche de la membrane plasmique. Le spermatozoïde est alors injecté ; dans l'ovocyte très rapidement après le retrait de la pipette, toute trace d'effraction disparaît.

L'ICSI a donc court-cicuité la dernière barrière membranaire ovocytaire et seul l'opérateur préside au choix du spermatozoïde injecté.

Une fois le spermatozoïde en place dans cette technique qui bouleverse tout le processus naturel de la fécondation, il va déclencher l'activation ovocytaire. Cette action semble être le fait d'un facteur cytosolique spermatique thermolabile qui, isolé et introduit dans le cytoplasme est aussi actif que le spermatozoïde lui-même, aspécifique, activant l'ovocyte humain comme l'ovocyte de souris. L'activation de l'ovocyte s'accompagne, après un temps de latence variable, d'une élévation de calcium intraovocytaire, prolongée et oscillatoire comme au cours de la fécondation normale physiologique [7].

Les résultats de l'ICSI ont dépassé toutes les espérances et si de très nombreux groupes en France [8] comme à l'étranger ont maintenant des taux de succès comparables à ceux de l'équipe pionnière belge, c'est cette dernière qui a la plus large expérience du fait de son antériorité. Ses résultats peuvent donc être pris comme base de référence [9].Sur les 2 853 cycles réalisés chez 1953 couples, de janvier 1991 à décembre 1994, l'ICSI n'a été impossible que dans 1,2 % des cas (33 cycles) soit par absence d'ovocytes recueillis (19 cas) ou d'ovocytes matures (7 cas) soit par absence de spermatozoïdes (7 cas). Parmi les 36 425 ovocytes traités, 81 % étaient matures et sains au recueil et 89 % d'entre eux ont supporté sans dommage la micro-injection aboutissant à 18 364 zygotes fécondés diploïdes soit 50 % des ovocytes recueillis et 62 % des ovocytes injectés. Seuls 3 % des cycles se sont soldés par un échec complet de fécondation mais 85 % des couples qui ont réalisé une nouvelle tentative ont obtenu des fécondations. Le pourcentage de zygotes parthénogénétiques (1PN) a été de 5.2 % et de zygotes à 3 PN de 6.7 % le plus souvent par non extrusion du2e globule polaire. Les taux de clivage, l'aspect morphologique des embryons et leur vitesse de division ne sont pas différents de ce qui est observé lors de la FIV classique. Enfin le taux de grossesses par cycle a été de 33 % (952/2820) auquel il faudra ajouter les grossesses issues de transfert des embryons congelés lors du cycle d'ICSI.

L'ICSI ne modifie en rien la congélabilité des embryons obtenus comparativement à la FIV classique même si les taux de grossesses cliniques par transfert d'embryons congelés restent modestes pour cette équipe (12.9% vs 10.7 %).Il ressort clairement de ces données qu'il est possible, grâce à l'ICSI, d'obtenir des résultats équivalents à ceux de la FIV traditionnelle... mais à partir de spermes gravement déficients.

III - Quelles sont les indicationsdes fécondations assistées ? Y-a-t-il des limites ?

1 - Paramètres du sperme éjaculé

Aucun des paramètres classiques du spermogramme n'est limitant, ni le nombre, ni la mobilité, ni la morphologie puisque les taux de fécondation sont de 58 % lorsque seuls quelques rares spermatozoïdes mobiles ont été retrouvés dans le culot de centrifugation et de 68 % en cas de tératospermies totales [10]. Le pourcentage de grossesses cliniques par transfert est de 25 à 30 % dans tous les cas. Deux exceptions cependant sont à relever : d'une part l'akinétospermie totale où il est difficile de faire la part entre spermatozoïdes vivants et morts ; les taux de fécondation (TF) ne dépassent alors pas 11 % et d'autre part les syndromes malformatifs par absence complète d'acrosome (TF=14 %).

2 - Origine des spermatozoïdes

Que les spermatozoïdes soient recueillis dans l'éjaculat, l'épididyme ou le testicule, les taux de grossesses par cycle sont équivalents et les taux de fécondation à peine abaissés avec le sperme épididymaire ou testiculaire, par rapport au sperme éjaculé (Tableau III) [9]. On peut utiliser du sperme épididymaire congelé ce qui permet de limiter le nombre des interventions pour ponction [11]. Ces résultats ont bouleversé le pronostic des azoospermies excrétoires, qui avaient depuis longtemps suscité espoirs et déceptions devant les faibles taux de succès consécutifs aux anastomoses épididymodéférentielles ou aux tentatives de création de spermatocèle mais également devant les médiocres taux de fécondation (7 % ) et de grossesses par cycle (4.5 %) obtenus en FIV conventionnelle après recueil chirurgical de spermatozoïdes épididymaires.

Mais le pronostic des azoospermies sécrétoires est également en voie de bouleversement : en effet, des travaux de plus en plus nombreux font état de la possibilité de récupérer, même dans les atteintes sévères de la spermatogenèse, des spermatozoïdes produits dans un si petit nombre de tubes et en si petite quantité qu'ils ne sont jamais retrouvés dans l'éjaculat. Leur fécondance ne semble en rien différente, à condition qu'ils soient mobiles, de celle des spermatozoïdes testiculaires non excrétés en raison d'une obstruction congénitale ou acquise [12].

3 - Degré de maturation des cellules germinales

Il devient possible d'obtenir des fécondations à partir de spermatides rondes (cellule haploïde mais n'ayant pas encore subi les transformations de la spermiogénèse) ce qui ouvre des perspectives thérapeutiques nouvelles même dans certains arrêts précoces de la spermatogénèse.Cependant pour le moment, les seules naissances rapportées l'ont été à partir de la microinjection de spermatides rondes recueillies dans l'éjaculat [13]. Des fécondations ont été obtenues à partir de spermatides rondes testiculaires [14] et même 4 grossesses dans une équipe ayant une expérience solide de cette technique chez le lapin. Les taux de succès ne dépasseraient cependant pas 4 % de grossesses par cycle. Il est également bien difficile d'affirmer l'innocuité de la méthode : certitude que l'on a bien injecté une spermatide haploïde, certitude que la maturation du noyau est complète et que les phénomènes d'imprinting en particulier sont achevés, etc.

4 - Etiologie de stérilités masculines

Les infertilités d'origine immunologique : les taux de succès obtenus dans cette indication, même lorsque le taux d'anticorps est très élevé, font de l'ICSI une méthode de choix pour ce type de pathologie masculine [15]. Les infertilités à composante génétique : plus reculent les limites de ce que l'on croyait physiologiquement impossible, plus les questions affluent sur l'innocuité de ces techniques et plus la vigilance s'impose afin de ne pas méconnaître les facteurs génétiques en cause ou associés à de telles pathologies et qui pourraient affecter la descendance.

C'est le cas de l'agénésie congénitale des canaux déférents (CAVD) dont on connaît le lien avec la mucoviscidose puisque la majorité des patients atteints de CAVD sont porteurs d'une ou plusieurs mutations du gène CFTR, la plus fréquente étant la mutation AF 508 ; d'où la nécessité d'une recherche systématique de mutation chez le couple et du recours au conseil génétique, si besoin, afin qu'aucune décision ne soit prise sans information claire et précise :

- c'est le cas des syndromes d'immotilité ciliaire qui peuvent parfois s'accompagner d'anomalies pulmonaires, voire faire partie d'un syndrome de Kartagener typique ;

- c'est le cas des oligospermies et azoospermies sécrétoires " idiopathiques " où l'incidence des anomalies chromosomiques (translocations, en particulier) est directement corrélée à l'intensité de la déficience spermatique, quand il ne s'agit pas d'une aneuploïdie gonosomique (Syndrome de Klinefelter ou mosaïques). Un caryotype systématique, permettra de donner aux couples une information et un conseil génétique " éclairé ".

5 - La place de la composante féminine

- Les facteurs ovocytaires : 70 à 80 % des ovocytes recueillis le jour de la ponction ont achevé leur maturité nucléaire et ces ovocytes en métaphase II seraient susceptibles d'être activés par la microinjection d'un spermatozoïde dans 90 % des cas [7]. Les échecs seraient donc essentiellement d'ordre technique ou spermatique. Par contre, les ovocytes immatures au recueil, même s'ils achèvent leur méiose très rapidement et sont microinjectés dans les heures suivantes ont une fécondabilité un peu réduite (TF = 50 % vs 64 %). Les autres ovocytes immatures n'achèveront leur maturité nucléaire en 20 à 40 h que dans 63 % des cas et 40 % d'entre eux seront normalement fécondés après ICSI [16].

- Les facteurs maternels : si l'ICSI connaît des succès importants, c'est d'une part grâce aux taux de fécondation élevés, mais aussi à la population traitée, plus volontiers composée de femmes jeunes qui n'ont jamais pu faire la preuve de leur fertilité en raison de la déficience spermatique grave de leur conjoint. Dès que l'on sort de ce schéma, les taux d'implantation diminuent. C'est le cas des femmes de plus de 40 ans qui, dans la série belge, représentent5 % de toutes les patientes et n'obtiennent que 8 % de grossesses et 4 % de naissances par cycle d'ICSI. C'est le cas des femmes dont le mari est hypofécondant en FIV classique (paucifécondations) mais qui ont cependant déjà bénéficié d'un ou plusieurs transferts d'embryon(s) sans succès comme nous l'avons relevé dans notre collaboration avec J. Belaisch-Allart (Hôpital de Sèvres ) et J. Salat-Baroux (Hôpital Tenon) [17]. L'ICSI résout les problèmes masculins... mais ne corrige pas les facteurs féminins défavorables, que ce soit l'âge ou les problèmes de nidation.

IV - Quel est le devenir des enfants de l'ICSI ?

Nouvelle percée technologique depuis la FIV, l'ICSI doit faire la preuve qu'il n'a aucun retentissement sur le devenir des enfants nés après microinjection. Pour l'instant la plus grande série accessible est bien sûr celle de l'équipe de Van Steirteghem et coll.

Au 1er septembre 1995, 877 enfants étaient nés après ICSI dont 23 porteurs d'une anomalie majeure soit un taux d'anomalies de 2.6 % qui ne diffère pas de celui de la population générale. Sur les 491 caryotypes fœtaux réalisés, par ailleurs, 6 anomalies de novo ont été constatées touchant principalement les chromosomes sexuels soit un taux de 1.2 % [9].

Pour l'instant le bilan est rassurant mais il faudra du recul et de larges séries pour conclure, d'autant que certaines malformations peuvent ne se révéler que tardivement, et que certains effets nocifs ne sont pas de l'ordre des malformations... ce qui souligne l'importance d'un suivi rigoureux des grossesses et des naissances consécutives à la technique d'ICSI qui demeure sans conteste pour le moment, le seul progrès significatif depuis des décennies dans le traitement des stérilités masculines sévères.

BIBLIOGRAPHIE

[1] Mandelbaum J. : Le traitement des stérilités masculines par la microinjection : une technique s'impose ; L'ICSI. Reprod. Hum. et Horm., 1995, 8, 285-294.

[2] Malter H., Cohen J. : Partial zona dissection of the human oocyte : a nontraumatic method using micromanipulation to assist zona pellucida penetration. Fertil. Steril., 1989, 51, 139-48.

[3] Lassalle B., Testart J. : Human sperm injection into the perivitelline space (SI-PVS) of hamster oocytes : effect of sperm pretreatment by calcium-ionophore A 23187 and freezing-thawing on the penetration rate and polyspermy. Gamete Res., 1988, 20, 301-311.

[4] Ng S.C., Bongso A., Ratnam S., Sathananthan H., Shan C., Wong P. C., Hagglund L., Anandakumar C., Wong Y.C., Goth V. : Pregnancies after transfer of sperm under the zona. Lancet, 1988, ii, 790.

[5] Fishel S., Jackson P., Antinori S., Johnson J., Versaci C. : Subzonal insemination for the alleviation of infertily. Fertil. Steril., 1990, 54, 828-35.

[6] Palermo G., Joris H., Devroey P., Van Steirterghem A. : Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet, 1992, 340, 17-18.

[7] Tesarik J., Sousa M., Testart J. : Human oocyte activation after intracytoplasmic sperm injection., Hum. Reprod., 1994, 9, 511-518.

[8] BLEFCO : La microinjection en France : Rapport de l'enquête multicentrique des BLEFCO. Contracept., Fertil., Sex., 1995, 23, 477-480.

[9] Van Steirteghem A., Liu J., Nagy P., Joris H., Staessen C., Smitz J., Tournaye H., Camus M., Liebaers I., DevrOEy P. : Microinsemination in " Fertility and Sterility : a current overview ". Proceedings of the 15 th World Congress on Fertility and Sterility, Montpellier 17-22, september 1995. Eds : Hedon B., Bringer J., Mares P., Parthenon Publish., 1995, 395-404

[10] Nagy Z.P., Liu J., Joris H., Verheyen G., Tournaye H., Camus M., Derde M.P., DevrOEy P., Van Steirteghem A.C. : The result of intracytoplasmic sperm injection is not related to any of the three basic sperm parameters. Hum. Reprod., 10, 1123-29.

[11] Devroey P., Silber S., Nagy Z., Liu J., Tournaye H., Joris H., Verheyen G., Van Steirteghem A. : Ongoing pregnancies and birth after intracytoplasmic sperm injection with frozen-thawed epididymal spermatozoa. Hum. Reprod., 1995, 10, 903-906.

[12] Silber S.J., Van Steirteghem A.C., Devroey P. : Seroli cell only revisited. Hum. Reprod., 1995, 333, No 8, 625.

[13] Tesarik J., Mendoza C., Testart J. : Viable embryos from injection of round spermatids into oocytes. Lancet, 1995, 2, 625.

[14] Vanderzwalmen P., Lejeune B., Nijs M., Segal-Bertin G., Vandamme B., Schoysman R. : Fertilization of an oocyte microinseminated with a spermatid in an IVF program. Hum. Reprod., 1995, 10, 502-503.

[15] Nagy Z.P., Verheyen G., Liu J., Joris H., Janssenswillen C., Wisanto A., Devrœy P., Van Steirteghem A.C. : Results of 55 intracytoplasmic sperm injection cycles in the treatment of male immunological infertility. Hum. Reprod., 1995, 10, 1775-1780.

[16] Junca A.M., Mandelbaum J., Belaisch-Allart J., Salat-Baroux J., Plachot M., Antoine J.M., Mayenga J.M., Delafontaine D., Cohen J. : Maturité et qualité ovocytaire : l'apport de l'ICSI. Fécondabilité des ovocytes microinjectés après maturation in vitro. Contracept., Fertil.,Sex., 1995, 23, 463-5.

[17] Salat-Baroux J., Mandelbaum J., Antoine J.M., Merviel P., Belaisch-Allart J., Boullu S., Cohen J., Junca A.M., Plachot M. : Indications de l'ICSI : influence possible de la qualité ovocytaire sur les résultats. Contracept. Fretil. Sex., 1995, 23, 481-83.

* Laboratoire de Recherche en Fécondation in vitro et Biologie de la Reproduction. Hôpital de Necker, 149, rue de Sèvres, 75743 Paris Cedex 15.
 : JOURNÉES DE TECHNIQUES AVANCÉES EN GYNÉCOLOGIE OBSTÉTRIQUE ET PÉRINATALOGIE PMA, Fort de France 11 - 18 janvier 1996