Place de nouveaux marqueurs spermatique  dans l’évaluation de l’infertilité masculine

S. Hamamah1, J-M Ayoubi2, F. Olivennes1, R. Frydman1, M. Benahmed3

1. Centre de Fécondation in vitro, Hôpital A. Béclère

     157 rue de la Porte de Trivaux, 92141 Clamart

2. Service de Gynéco-Obs, CHU de Grenoble, Grenoble

3. INSERM U 407, CHU Lyon Sud, Lyon

INTRODUCTION

            Le sperme humain se compose des spermatozoïdes et du plasma séminal d'origine vésiculaire, d'origine épididymaire et prostatique et glandes bulbo-urétrales qui sont riches en mucoprotéines (lubrification).

            Le plasma séminal  se constitue au moment de l'éjaculation  par le mélange au fond du vagin de secrétions de diverses origines: testiculaires, épididymaires, prostatiques, vésiculaires et sériques. Il est le résultat d'une serie de sécrétions, migrations, réabsorptions, maturations. Les différentes sécrétions ne sont pas émises simultanément. Lors de l'éjaculation, le sphincter lisse de l'urétre se ferme, le plasma épididymaire et les spermatozoïdes en réserve dans la queue de l'épididyme sont émis, entrant ainsi en contact avec la sécrétion prostatique. Il se produit probablement des interactions entre ses 3 composants à ce moment là. Secondairement le fluide vésiculaire rejoint l'éjaculat. Vu la séquence éjaculatoire des fractionnements de l'éjaculat en 5 ou 6 fractions permettent de récupérer des fractions pures correspondantes aux différentes sécrétions. Il faut noter que tout le matériel sécrété dans les différentes parties du tractus n' est pas incorporé au plasma séminal. En effet, il y a des réabsorptions avant le canal urétral notamment des sécrétions testiculaires et épididymaires. Il varie en composition selon les éspèces, les individus, avec le moment, l'âge et différents facteurs intercurrents. 100 à 200 proteines ou peptides ont été observés et leur dosage va impliquer obligatoirement, la nécessité de connaître leur origine pour évaluer la contribution relative de chaque compartiment. Ce mélange coagule puis se liquéfie pour constituer un milieu plus ou moins homogéne et les interactions enzymatiques permettent l'apparition de substances nouvelles, qui peuvent être biologiquement actives. Le plasma séminal est un milieu en perpétuel évolution. Ce mécanisme complexe s'explique du fait que certains composants actifs sont stockés que sous formes de précurseurs.

            L'étude des caractéristiques du sperme constitue donc le reflet de l'activité testiculaire et des évènements post-gonadiques, en particulier, la maturation épididymaire. Ces processus sont pour la plupart, non seulement sous le contrôle du système neuroendocrinien, mais aussi, sous le contrôle de facteurs locaux tels que les facteurs de croissance et les cytokines. Dans cette revue, nous faisons le point sur les nouveaux marqueurs dans le plasma seminale de obtenues dans le cadre de l’exploration de l’homme infertile.

I. Composition chimique du plasma séminal

            Depuis la découverte de l'acide citrique en 1929 ont été mis en évidence: des glucides libres (Glucose, fructose, sorbitol) et liés, des acides organiques (acide citrique, ascorbique), des substances azotées non protéiques (polyamines, carnitines, cholines), des protéines sériques (Albumine, immunoglobulines, hormones peptidiques), des protéines cellulaires  Calmoduline), des protéines spécifiques (lactoferrine, inhibiteurs de protéases), des lipides (Prostaglandines, phosphorylcholine, cholestérol, stéroides), des enzymes (Proteases, glucosidases phosphatases, transferases), AMP cyclique, et des composés minéraux (Zn, Ca, Mg). Plus récement, des facteurs de croissance (TGFa, TGFb, IGF I ,II, EGF...) et des cytokines ont été mis évidence dans le plasma séminal de l’homme fertile et infertile. Il y a également, un certain nombre de composés organiques qui sont retrouvés à des taux anormalement élevés. Par rapport au sérum, les taux sont en général plus élevés d'une façon significative sauf pour l'acide urique et la phosphatase acide qui présente de grosses variations dans les deux sens. Au contraire des autres fluides de l'organisme, l'osmolarité du plasma séminal dépend plutôt des composés organiques qu'inorganiques. De plus, certains composés tels choline, sorbitol, spermine sont plus proches biochimiquement des plantes ou des microorganismes. La raison de cette composition particulière n'est pas trés claire. Est elle due au métabolisme des glandes annexes à turn-over rapide parce que hormono-dépendantes ou à la concentration excessive de produits endogénes ?

II - Expression des facteurs de croissance et des cytokines dans le testicule :

            relation avec le systeme endocrinien

            A la différence du système endocrinien, les facteurs de croissance et les cytokines agissent, en principe, sur leur lieu de production même d’où la notion d’action locale. Cette action locale permet à la cellule au sein d’un organe, d’appréhender son environnement immédiat (action autocrine) ou de communiquer avec une autre cellule (action paracrine). Ce sont ces modes de communication que l’on retrouve au sein du testicule, par exemple entre les cellules de l’espace interstitiel et les cellules du tube séminfère d’un part (comunications cellules de Leydig-cellules de Sertoli) et d’autre part entre les différentes cellules du tube séminifère (comunications cellules de Sertoli-cellules germinales).

            Les facteurs de croissance et les cytokines ont été classés en une dizaine de famille sur les bases de leurs analogies structurales. Un autre type de classification intéressant est de les regrouper selon les systèmes de transduction qu’ils utilisent pour transmettre leur message au noyau et donc aux différents gènes de leurs cellules cibles. A titre d’exemple, on distingue les facteurs qui exercent leurs actions par l’intermédiaire de récepteurs à tyrosine kinase (ex : EGF/TGFa, FGFs, IGFs, SCF), de récepteurs à sérine/thréonine kinase (ex : TGFb, activine, AMH). D’autres molécules de signalisation peuvent utiliser plusieurs systèmes de transduction intracellulaire (ex : le TNFa). Enfin, certains facteurs exercent leur action par le même récepteur et le même système de transduction (ex : EGF et TGFa).

            Les molécules que nous décrivons sont exprimées dans différents organes. Cependant, il existe parfois des spécificités liées à l’organe où elles sont exprimés et où elles agissent. Ces molécules (ligands et récepteurs) sont présentes sous forme d’ARN messagers et de protéines dans les différents types de cellules testiculaires et à différents stades du développement gonadique. L’expression de ces facteurs locaux peut être spécifique d’un type cellulaire ou d’un stade de développement testiculaire. Ainsi, certains facteurs sont produits principalement par les cellules somatiques, par exemple, le SCF et l’AMH sont produits par les cellules de Sertoli, IGF I est exprimé dans les cellules de Sertoli et les cellules de Leydig. D’autres sont exprimés surtout dans les cellules germinales comme le NGF et le TNFa. Enfin, le TGFb et l’EGF/TGFa sont exprimés de façon ubiquitaire (cellules somatiques et cellules germinales). Cette expression spécifique d’un type cellulaire ou d’un stade de développement fait intervenir des éléments de régulation transcriptionnels ou post-transcriptionnels. Par exemple, des gènes ayant des promoteurs multiples présentent une organisation propice à la régulation cloisonnée au niveau des différents tissus (ex : le NGF utilise des promoteurs différents dans le testicule et dans le cerveau). L’épissage alternatif des préARN messagers peut faire apparaître ou non un site de protéolyse qui permet le ciblage sub-cellulaire d’une molécule (ex : production de SCF soluble ou membranaire). Il faut noter que l’expression des facteurs locaux est modulée par les hormones. Ce contrôle porte aussi bien sur les ligands et les récepteurs. Il reste cependant à déterminer le niveau de contrôle où s’exerce l’action des hormones (transcription, modification post-transcriptionnelle comme l’épissage alternatif, traduction en protéine)

III. Application clinique de l’evaluation des facteurs locaux testiculaires

            Les facteurs de croissance et les cytokines peuvent jouer un rôle important (i) dans la formation du spermatozoïde, (ii) dans l’acquisition de son pouvoir fécondant, (iii) dans sa protection vis-à-vis du système immunitaire mâle (qui ne le reconnaît pas comme du “ soi ”) et femelle et enfin, (iv) au moment de l’interaction avec la zone pellucide de l’ovocyte.

            Compte tenu du rôle potentiellement important des facteurs de croissance et des cytokines dans la physiologie testiculaire, deux questions se posent lorsque nous abordons la pathologie testiculaire et en particulier dans les oligo et les azoospermies sécrétoires dont la cause n’est pas clairement identifiée (1):

                        a - Dans une démarche diagnostic, existe-t-il des modifications de la production de ces molécules de signalisation dans les oligo et les azoospermies sécrétoires ? En d’autres termes, le niveau d’expression dans le tissu testiculaire, les taux plasmatiques et les concentrations dans le liquide séminal de ces molécules peuvent-ils être utilisés comme marqueurs de ces pathologies et plus spécifiquement, comme marqueurs de la perturbation d’un type de cellules testiculaires ?

                        b - Dans une démarche thérapeutique, ces molécules peuvent-elles être utilisées pour corriger certains troubles de la spermatogenèse et/ou le pouvoir fécondant du spermatozoïde ?

1. Exploration des facteurs de croissance et des cytokines chez l’homme infertile:

            Les molécules de signalisation peuvent être recherchées au moins à trois niveaux différents : (i) le sang, (ii) le tissu testiculaire (iii) le plasma séminal et.

            1- Le sang

            En principe, les facteurs de croissance et les cytokines à la différence des hormones ne sont pas présents dans le sang puisque leur action est de type local (auto/paracrine) c’est-à-dire qu’ils agissent à l’endroit même où ils sont sécrétés. Cependant, certains facteurs comme l’IGF I, les peptides apparentés du TGFb (ex : les inhibines) ou même l’EGF (en particulier dans le modèle murin) se comporteraient aussi comme des hormones puisqu’ils sont retrouvés dans le sang, dans des conditions physiologiques (2, 3). Cependant, l’origine multiple (production dans différents organes) de ces facteurs fait que pour beaucoup, l’évaluation de leur taux sanguin ne reflète en aucun cas l’activité (d’un type cellulaire) du testicule. Pour certains peptides apparentés du TGFb, en particulier l’inhibine B, différents travaux (2) semblent indiquer que, son taux plasmatique pourrait refléter l’activité des cellules de Sertoli. Si ces observations se confirmaient, elles présenteraient un intérêt majeur dans la mesure où elles permettraient de différencier les oligo et les azoospermies sécrétoires des oligo et des azoospermies excrétoires lorsque les taux plasmatiques de FSH ne peuvent le permettre (4).

            2- Le tissu testiculaire

            La recherche de molécules de signalisation au niveau du tissu testiculaire fait appel à différentes techniques permettant d’identifier le signal au niveau du mRNA (hybridation in situ, RT-PCR, northern blotting) et/ou de la protéine (western blotting, immunohistochimie). Dans ce contexte, différentes molécules de signalisation comme IGF I, EGF , SCF, c-kit (revues 5, 6, 7) ont été identifiées, en général par des techniques d’immunohistochimie. Compte tenu des faibles quantités de tissus testiculaires obtenus, la RT-PCR pourrait s’avérer une technique intéressante pour :

                        • identifier les messagers recherchés et leurs récepteurs

                        • identifier des anomalies de type délétion, mutations, modification de l’épissage alternatif. La RT-PCR pourrait être intéressante pour une approche visant à détecter plutôt des anomalies qualitatives que quantitatives. En effet, une augmentation ou une diminution du niveau d’expression d’une molécule de signalisation ne signifie pas pour autant une atteinte quleconque puisque’à l’état physiologique, le niveau d’expression varie de façon considérable dans le cadre d’interactions cellulaires et en particulier entre les cellules de Sertoli et les cellules germinales au cours des différentes phases de la spermatogenèse.

            3- Le plasma séminal

            Le plasma séminal constitue le milieu biologique où l’on retrouve les sécrétions testiculaires, épididymaires mais surtout celles des vésicules séminales et de la prostate. En conséquence, la mise en évidence dans le plasma séminal d’un facteur de croissance ou d’une cytokine doit tenir compte de ces origines multiples. De nombreuses molécules de signalisation ont été identifiées dans le plasma séminal (tableau 1).

            Peut-on corréler les taux de ces facteurs avec les différentes étiologies des oligo et azoospermies ? Des précautions doivent être prises quant à l’origine testiculaire ou extra-testiculaire et quant aux types de dosages utilisés (RIA, ELISA, bioactivité). Aussi, les dosages utilisés doivent tenir compte de la nature protéique des facteurs de croissance et des cytokines. En effet, un anticorps donné (dans un dosage immunologique donné) reconnaît une (des) séquence(s) polypeptidique(s), ce qui peut expliquer des variations de résultats importantes entre les différents kits (c’est-à-dire les différents anticorps) du commerce. Par ailleurs, un anticorps reconnaît dans le peptide une (des) séquence(s) d’acides aminés qui ne reflètent pas forcément l’activité biologique de ce peptide. Dans ces cas, seuls des dosages de bioactivité (utilisant par exemple des lignées cellulaires avec un marqueur spécifique du peptide étudié) ou un dosage par radio-récepteur peuvent valider le dosage immunologique. Par ailleurs, cette approche devrait aussi permettre de sélectionner parmi les kits du commerce (qui sont de plus en plus nombreux), ceux qui donnent des valeurs les plus proches de celles du dosage biologique.

            Quelques travaux rapportent des variations du taux dse facteurs de croissance et des cytokines dans le plasma séminal de patients stériles (8, 9, 10, 11). Pour la grande majorité de ces facteurs, et en particulier pour les cytokines, il semble que leurs taux varient en fonction de l’état infectieux du tractus génital (tableau 1). En ce qui concerne les facteurs de croissance, les travaux sont encore rares et seules des précautions minitieuses devraient permettre d’utiliser ces molécules comme marqueur de l’état fonctionnel de la spermatogenèse.

2. Action in vitro des facteurs de croissance et des cytokines sur le sperme provenant de patients infertiles

            A l’état physiologique, à la sortie du testicule, les spermatozoïdes sont incapables de féconder l’ovule. Ils acquièrent leur pourvoir fécondant lorsqu’ils traversent le canal épididymaire. Pour que la fécondation ait lieu, il faut que les spermatozoïdes reconnaissent la zone pellucide, s'y fixent, qu'ils la pénètrent et qu'il y ait fusion avec la membrane plasmique de l'ovocyte.

            Différents travaux indiquent qu’au delà du rôle des cytokines sur la formation des spermatozoïdes, ces molécules peuvent affecter l’état fonctionnel des gamètes. TGFb, IL1, IL2, GM-CSF se sont révélés sans effets particuliers sur la fonction des spermatozoïdes (12, 13). Par contre, l’interféron a et t ainsi que le TNFa ont un effet délétère sur la mobilité des spermatozoïdes ainsi que sur la pénétration dans la zone pellucide de l’ovocyte (14, 15). Cependant, le traitement des hommes stériles par l’IFN a permis d’améliorer le nombre et la mobilité des spermatozoïdes (16). Bien que ce travail paraisse prometteur, d’autres travaux demeurent nécéssaires pour comprendre, en particulier, l’apparente contradiction entre les observations obtenues in vivo et in vitro.

            Les facteurs de croissance ayant des récepteurs à tyrosine kinase mais probablement aussi à sérine thréonine kinase pourraient s’avérer intéressant dans le pourvoir fécondant du spermatozoïde et au moment de l’interaction inter-gamétique. Parmi les facteurs de croissance à récepteurs tyrosine kinase d’intérêt, l’EGF/TGFa, les récepteurs de l’EGF sont présent sur les spermatozoïdes où ils sont fonctionnels. Naz et al. (17) ont observé une absence d’effet in vitro de l’EGF sur le pouvoir fécondant du spermatozoïde (en présence de faibles concentrations d’EGF) alors qu’ils observent en présence de fortes concentrations d’EGF un effet inhibiteur sur la mobilité du spermatozoïde, sur le taux de pénétration des ovocytes de Hamster (Hamstertest), sur la réaction acrosomique spontanée ou induite par le calcium ionophore. Ces résultats devront être confirmés. Les mêmes auteurs ont utilisé de l’EGF recombinant dont la bioactivité au niveau du plasma séminal doit être validé. Enfin, l’IL6 apparaît comme une des molécules intéressantes dans le cadre du traitement de la stérilité masculine, puisque cette cytokine a été déctectée dans le plasma séminal d’hommes infertiles à des taux élévés (infections ?). Son action sur le pouvoir fécondant des spermatozoïdes in vitro présente quelques intérêts. En effet, l’IL6 semble améliorer le pourcentage de formes mobiles et augmenter la réaction acrosomique spontanée ou stimulée par le calcium ionophore.

CONCLUSIONS

            Différentes étapes cruciales nécéssaires à l’obtention de spermatozoïdes fonctionnels semblent être en relation avec les activités pléiotropiques des facteurs de croissance et des cytokines comme (i) la formation et le développement de la gonade fœtale, (ii) la mise en place de la spermatogenèse à la puberté, (iii) l’acquisition du pouvoir fécondant dès la sortie du testicule, (iv) la protection des spermatozoïdes vis-à-vis des systèmes immunitaires mâle et femelle et enfin (v) l’interaction avec la gamète femelle. A la différence du système endocrinien, qui agit à distance, les facteurs croissance et les cytokines constituent un système de contrôle local c’est-à-dire que ces facteurs exercent leurs activité biologique là où ils sont produits.

            Il existe des interactions étroites entre le système endocrinien et le système local. D’une part, en contrôlant l’expression des facteurs de croissance et des cytokines dans le testicule, le système endocrinien pourrait utiliser le système local comme un relais, en particulier pour réguler la spermatognèse (mitose, méiose, diférenciation et apoptose). D’autre part, les facteurs locaux peuvent à leur tour amplifier ou inhiber l’action des hormones et ce probablement afin d’adapter finement l’action hormonale aux besoins de la spermatogenèse. Il est tout à fait possible que les interactions hormones-facteurs locaux soient beaucoup plus importantes lors de la formation des gamètes (étape testiculaire) plutôt que lors de l’acquisition du pouvoir fécondant (étape post-testiculaire).

            Ainsi des anomalies potentielles affectant l’expression et/ou l’action des facteurs locaux à l’une de ces étapes, pourraient entraîner une situation d’infertilité. Les anomalies pourraient, en particulier, rendre inefficace le système endocrinien dont l’action est décisive pour la spermatogenèse. D’ailleurs des données expérimentales de transgenèse (knock-out ou surexpression) montrent qu’une expression inadéquate de facteurs de croissance ou des cytokines peut aboutir à la stérilité (tableau 2). Sachant qu’un très grand nombre d’infertilités, en particulier les oligo et les azoospermies sécrétoires, restent encore inexpliquées, il apparait donc important d’essayer d’utiliser les connaissances acquises sur ces facteurs pour tenter d’expliquer ces pathologies testiculaires.

            Ces molécules sont recherchées dans le tissu testiculaire, le plasma sanguin et le plasma séminal. Le tissu testiculaire offre peu-être les possibilités les plus intéressantes pour essayer d’identifier différents types d’anomalies entraînant des pertes de fonctions du ligand, du récepteur, du système de transduction ou des facteurs de transcription utilisés par les facteurs locaux pour contrôler l’expression de leurs gènes cibles. Le plasma sanguin pourrait s’avèrer intéressant pour détecter des molécules de signalisation provenant de cellules de Sertoli. L’exemple de l’inhibine B pourrait être suivi par la mise en évidence d’autres marqueurs intéressants.

            Enfin, le plasma séminal, qui est le résultat des sécrétions gonadiques et extra-gonadiques, pourrait permettre d’identifier des molécules marqueurs des différents types d’oligo et d'azoospermies sécrétoires et excrétoires. Les facteurs de croissance et les cytokines étant avant tout des peptides, leur manipulation et identification dans un milieu complexe comme le plasma séminal, requiert néanmoins énormément de précautions si l’on ne veut pas s’exposer à des risques de mauvaises exploitations/interprétations des données obtenues. les informations fournies par la biochimie séminale sont déterminants pour le diagnostic des états infectieux et /ou inflammatoires des glandes annexes, elles permettent également, de différencier les différents types d'azoospermies et même quelquefois de préciser le lieu de l'occlusion. De nouvelles approches telles que l’evaluation de facteurs de croissances et de cytokines dans le sperme humain sont à l'heure actuelle à l'étude et demande encore des explorations complémentaires pour être validées et expliciter plus précisement les interactions spermatozoïdes et plasma séminal, les troubles de la perméabilité membranaire ou certains déficits enzymatiques.

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