Les milieux de culture ou additifs utilisés dans le cadre de l’AMP doivent répondre à 2 critères : efficacité et innocuité. Cela peut sembler un truisme et pourtant si l’efficacité a été rapidement démontrée pour certains milieux (taux de fécondation, qualité embryonnaire et taux de grossesse) il faut admettre que jusqu’à ces dernières années, peu de contrôles étaient effectués ; ils se limitaient à des contrôles physico-chimiques et bactériologiques. Aujourd’hui, les principaux milieux utilisés dans le cadre de l’AMP font l’objet de contrôles systématiques plus approfondis et spécifiques à l’AMP incluant par exemple le taux d’endotoxines, la survie des spermatozoïdes humains, la fixation des spermatozoïdes sur la zone pellucide des ovocytes humains, l’intégrité de la zone pellucide des ovocytes humains, la culture d’hybridome murin et/ou la culture d’embryons murins ou bovins jusqu’au stade de blastocyste (3 ; 5) (Tableau I).

Les milieux contiennent le plus souvent de la sérumalbumine d’origine humaine (HSA) ou bovine (BSA), des sels minéraux organiques et/ou non organiques, des acides aminés (d’origine ovine ou bovine) et des vitamines. Or, ces milieux n’ont pas de statut. En effet ce ne sont pas des médicaments (et ne relèvent donc pas d’une AMM), ni des réactifs de laboratoire. Pourtant ils constituent le premier milieu dans lequel baigne l’embryon, milieu injecté dans l’utérus lors du transfert. Les professionnels se sont interrogés sur cette absence de statut et ont demandé à différentes instances de remédier à cette lacune, en vain. La tâche semblait ardue d’inventer pour ces produits un statut spécifique qui leur permette à la fois d’être parfaitement contrôlés, rapidement mis sur le marché et évolutifs.

La prise de conscience récente des risques infectieux potentiels liés à l’utilisation de produits d’origine humaine ou bovine en clinique humaine a mis le feu aux poudres. En janvier 1997, une enquête a été diligentée par la Direction Générale de la Santé (DGS) concernant les milieux de culture, additifs et autres produits utilisés en AMP . Les industriels ont été " invités " à présenter le dossier de fabrication de ces produits, lesquels ont été évalués par le Conseil Supérieur d’Hygiène Publique de France comprenant un groupe d’experts sur la sécurité microbiologique des dispositifs médicaux, produits et procédés utilisés à des fins médicales. Le verdict est tombé : le milieu B2 (CCD) le plus utilisé en France, et largement utilisé à l’étranger était interdit. D’autres produits sont actuellement évalués par le groupe d’experts. C’est un travail de longue haleine : presque tous les dossiers sont renvoyés aux fournisseurs pour demande d’informations complémentaires ce qui conduit la commission à un sursis à statuer. Lorsque les informations fournies montrent que la sécurité microbiologique du produit est insuffisante, le produit est interdit. Lorsqu’en revanche le procédé de fabrication montre que toutes les précautions ont été prises, le produit a un avis favorable, ce qui équivaut à un " label ". Une proposition de loi sur la sécurité sanitaire prévoit, outre un institut de veille épidémiologique et une agence de l’alimentation et de l’eau, une agence des produits médicaux qui élargirait l’actuel champs de compétences de l’agence du médicament aux dispositifs médicaux et aux produits sanitaires annexes.

Toujours est-il que les milieux de culture font des vagues ; les professionnels n’ont pas fini d’être secoués par cette lame de fond.

Les risque liés à l’utilisation des milieux de culture dans le cadre de l’AMP vont être illustrés à partir de 3 exemples : la sérumalbumine humaine ou bovine et le Percoll.

Plusieurs milieux commercialisés contiennent de la sérumalbumine humaine : BM1, Elliostep 2 (Ellios), IVF (Medi-cult), B9 (C.C.D.), Ferticult (J.C.D.) ; de plus, la sérumalbumine humaine peut être un additif pour certains milieux de culture.

Pour que ce produit biologique puisse être utilisé dans le cadre de l’AMP, il est demandé au promoteur de présenter au groupe d’experts un dossier comportant :

• les critères de sélection des donneurs de sang : examen clinique, interrogatoire et antécédents. Un questionnaire doit permettre d’éliminer du don les sujets à risque identifié de maladie de Creutzfeldt-Jakob (par exemple : sujets traités par l’hormone de croissance ou sujets transfusés). Les donneurs ne doivent pas être rémunérés ;
• la recherche d’une infection par HTLV1, CMV, EBV, VIH, VHC, VHB ou d’une syphilis ;
• les techniques et les tests commerciaux utilisés pour la recherche de ces infections ;
• des précisions sur l’existence d’une traçabilité et sur la conservation d’un échantillon des pools de plasma ;
• le procédé précis et détaillé de fabrication de l’albumine. On admet qu’une cryoprécipitation suivie de 3 précipitations et d’un traitement à 60°C pendant 10 heures sont suffisants pour garantir l’absence de risque de contamination virale.

La commission s’est quelquefois heurtée au problème de confidentialité industrielle des dossiers : refus de donner des informations ou refus de les envoyer par courrier, par fax, etc...

Récemment, Irvine Scientific a informé les utilisateurs d’un certain lot d’albumine humaine que l’un des donneurs dont le sang avait été utilisé pour fabriquer cette albumine était mort de la maladie de Creutzfeldt-Jakob. Il semblerait - fort heureusement - que cette albumine n’ait pas été utilisée pour une AMP en France. Nous n’avons aucune information sur son éventuelle utilisation à l’étranger. Il est clair que vu la durée d’incubation de cette maladie, le sujet ne connaissait pas son état au moment du don. Par ailleurs, aucun test ne permettait de dépister la maladie. La réaction du fournisseur a été rapide : information de tous les acheteurs en leur demandant de ne plus utiliser ce produit. Indépendamment de l’angoisse que peut générer une telle information, voilà un exemple d’une bonne traçabilité du produit avec information immédiate des utilisateurs.

La sérumalbumine bovine est l’un des composants de nombreux milieux de culture utilisés en recherche animale. Son efficacité bien démontrée est la raison pour laquelle elle a fait partie des constituants du premier milieu spécifique pour la culture de gamètes (B2) mis au point en 1976 par Menezo (2). Ce milieu a été utilisé pour certainement plus de 100.000 cycles d’AMP réalisés en France et à l’étranger entre 1981 et 1997, ayant conduit à la naissance de plusieurs dizaines de milliers d’enfants. Or, il existe un risque potentiel de contamination par les prions pouvant être transmis par des produits biologiques bovins et ovins. Il faut savoir que les prions sont des protéines infectieuses très résistantes, pouvant être inactivées soit par un autoclavage à 134°C pendant 18 minutes, soit par un traitement à l’hypochlorite de soude normale pendant 1 heure à 20°C (pour plus de sécurité, les deux procédés peuvent être associés). Or, outre la sérumalbumine bovine, le B2 contient du cholestérol d’origine ovine et des acides aminés d’origine bovine ou porcine. Enfin, le laboratoire qui fabrique ces acides aminés (Laboratoire Merck) précise qu’ils ne doivent pas être utilisés chez l’homme ou l’animal. Il n’était donc pas possible aux experts de donner un avis favorable à un milieu incorporant des acides aminés ne devant pas être utilisés chez l’homme (quelle que soit la sécurité présentée par ces produits).

Une circulaire de la DGS envoyée à tous les professionnels demandait donc de ne plus entreprendre de nouveaux traitement de gamètes ou d’embryons à l’aide de ce milieu, sauf pour les cycles en cours. Cela a produit une effervescence considérable dans les laboratoires de FIV où les biologistes ont en urgence commandé d’autres milieu chez d’autres fournisseurs qui se sont vite trouvés à cours de stock.

Par chance, toute cette agitation autour des milieux de culture a été peu médiatisée. En effet, que dire à ces couples dont les embryons ont été conçus et cultivés dans un milieu jugé suffisamment dangereux par la DGS pour être interdit ? Que dire à ceux qui ont encore des embryons congelés dans ce milieu ?

Heureusement, de manière consensuelle, les professionnels, en accord avec la DGS, ont décidé de ne pas informer spécifiquement les couples de ces changements de milieux, mais d’expliquer à ceux qui souhaitaient des explications que ces modifications représentent le début d’un processus fondé sur le principe de précaution qui va progressivement générer des milieux de culture de plus en plus sûrs. Un exemple permet d’ailleurs aux patients d’apprécier cette évolution : les voitures qui sortent actuellement ont un air-bag de sécurité ; ce n’est pas pour autant que l’on empêche les autres de rouler.

La labellisation d’un milieu contenant un produit biologique d’origine ovine ou bovine doit donc désormais comporter des renseignements concernant :

• le mode d’élevage et d’alimentation des animaux, nature des abattoirs, contrôle vétérinaires ;
• la recherche d’endotoxines, de virus, de bactéries et de levures ;
• le procédé de fabrication de l’albumine ou des acides aminés en précisant les étapes d’inactivation mises en oeuvre ;
• les fournisseurs étrangers, l’estampille CEE ;
• la traçabilité du produit fini.

Le laboratoire a donc modifié la formule du B2 désormais appelé B2 ART (Assisted Reproductive Technology) en remplaçant les acides aminés d’origine bovine ou porcine par d’autres, d’origine biosynthétique ou végétale pour usage humain intraveineux, donc ayant un niveau de sécurité pharmaceutique. Lorsque c’était impossible, ils ont été supprimés comme c’est le cas pour le cholestérol. Quant à l’albumine bovine (à l’origine de toute cette affaire), elle a été considérée comme étant utilisable (troupeaux contrôlés, traçabilité parfaite).

Il est important de rappeler ici que, outre la sécurité microbiologique et toxicologique, l’efficacité de ces milieux modifiés voire appauvris doit être démontrée. Ce travail est en cours.

Le modèle idéal serait un milieu dans apport protéique exogène auquel on ajouterait du sérum ou du fluide folliculaire de la patiente, voire un milieu constitué exclusivement de l’un de ces 2 produits biologiques autologues.

A défaut, que faut-il mieux utiliser ? De la HSA ou de la BSA ?

Pour choisir entre ces deux produit, il faut tenir compte de plusieurs éléments : vis à vis du risque de transmission des agents transmissibles non conventionnels, tels que les prions, à niveau de sécurité équivalent, l’albumine bovine pourrait apporter un élément supplémentaire de sécurité du fait de la barrière d’espèce. Cependant, en l’occurrence, même si l’albumine bovine, après contrôle du procédé de fabrication, ne présente pas de risque notable, son niveau de sécurité est obligatoirement inférieur à une albumine humaine avec AMM.

Les avis rendus sont de trois types :

• Avis favorable : toutes les garanties (en l’état des connaissances actuelles) ont été apportées par le fabricant et l’usage de ces produits ne présente pas de risque microbiologique.
• Sursis à statuer : quelques informations demandées par les experts ne leur ont pas encore été fournies mais l’usage de ces produits peut être maintenu dans l’attente des informations manquantes.
• Refus : les experts considèrent que ces produits ne présentent pas assez de garanties sur le plan de la sécurité microbiologique et demandent une suspension de ces produits.

Cette suspension peut être :

• temporaire : dans l’attente d’informations complémentaires ;
• définitive : lorsque les informations fournies aux experts montrent que la sécurité microbiologique ne peut être garantie.

• Milieu B9 et Milieu B2 ART, du Laboratoire C.C.D. (en remplacement du B2 I.N.R.A. de Menezo)
• Ferticult, de Fertipro
• Albumine humaine (réf. : 9988), Sperm washing medium + albumine humaine (réf. : 9983), Milieu de congélation du sperme + jaune d’oeuf (réf. : 9971), Sperm maintenance medium (réf. : 99176), de Irvine Scientifique / Clinisciences SA

• Milieu M1, de Cryo-Biosysteme : suspension temporaire dans l’attente de renseignements complémentaires.
• Albumine bovine (réf. : 1092), de Irvine Scientifique / Clinisciences SA : suspension définitive.
• Sperm washing medium + albumine bovine (réf. : 9984), de Irvine Scientifique / Clinisciences SA : suspension définitive.

• BM1, de Ellios Bio Media / Axcell Biotechnologies
• IVF 50, de Scandinavian IVF
• Universal IVF medium, EFM1, SPM, M3, de OSI / Medi-Cult
• Sérum humain inactivé à la chaleur, de l’Institut Jacques Boy
• Substitut de sérum (réf. : 99193), de Irvine Scientifique / Clinisciences SA
• Sérum de Veau Foetal, de C.N. Biomedicals / P.A.A. Laboratories
• Sérum de Veau Foetal, de Eurobio

Les produits d’origine biologique n’apparaissant pas sur cette liste n’ont pas été soumis à l’avis du groupe d’experts sur la sécurité microbiologique.

De même qu’il y a une saga du B2, il y a une saga du Percoll.

Le Percoll est une substance largement utilisée dans le cadre de l’AMP (depuis plus de 10 ans) pour la préparation du sperme en vue d’IAC, de FIV ou d’ICSI. Elle permet de séparer les spermatozoïdes mobiles du reste de l’éjaculât grâce à un gradient de densité. Alors que la technique de migration (swim-up) est très efficace lorsque le sperme est normal, la technique de centrifugation sur gradient de densité est la technique de choix en cas d’OATS, et de ce fait, est très utilisée dans le cadre de l’ICSI. De nombreux centres d’AMP ont choisi cette technique de manière systématique pour toutes les préparations de sperme quelle que soit leur qualité. Nous avons choisi de la réserver aux spermes déficients, ou en cas de sperme normal, aux patients ayant des antécédents d’échec ou de paucifécondation. Le Percoll est constitué de particules de silice enrobée de polyvinylpyrrolidone (PVP). Bien que la technique de centrifugation sur gradient de densité implique un lavage final de la suspension de spermatozoïdes pour éliminer le Percoll, on ne peut affirmer que le sperme utilisé pour l’insémination ou l’injection ne comprend absolument plus de particules. Devant cette incertitude, 2 études ont recherché une éventuelle cytotoxicité du Percoll in vivo et in vitro. Arora et coll. (1) ont injecté directement 50 µl de Percoll à 60 % dans la corne utérine et l’ovaire gauche d’une lapine et 50 µl de sperme préparé par Percoll dans la corne utérine droite. Cornes et ovaires ont été prélevés 4 semaines plus tard et analysés en histologie. Aucun signe d’inflammation n’a été détecté de quelque côté que ce soit. Qui plus est, sous lumière polarisée aucune particule de silice n’a été retrouvée. Scott et Smith (4) ont mesuré le taux d’endotoxines présentes dans le Percoll et analysé les effets de l’utilisation de ce produit pour la préparation du sperme sur la fécondation in vitro, le développement et la viabilité des embryons de souris. Ils ont montré que l’utilisation de ce produit dans ces conditions était compatible avec la fécondation et le développement embryonnaire. En revanche, la culture des embryons dans un milieu contenant 20 % de Percoll (absolument pas utilisée en clinique humaine) induit une réduction de la viabilité embryonnaire. La recherche d’endotoxines s’est révélée négative.

Les résultats de ces deux études sont plutôt rassurants. Et pourtant, le fabricant (Pharmacia Biotech) a envoyé un courrier à tous les utilisateurs de Percoll leur rappelant que ce produit était destiné à la recherche et ne devait en aucun cas être utilisé en clinique humaine. En effet, les contrôle réalisés sur ce produit sont jugés (par le fabricant) insuffisants pour l’utiliser dans le cadre de l’AMP. Le fabricant a demandé aux acheteurs de renvoyer un formulaire signé indiquant qu’ils n’utilisent plus le Percoll dans le cadre de l’AMP depuis janvier 1997 et qu’ils seraient seuls tenus pour responsables de tout problème survenant avec ce produit et pouvant donner lieu à des poursuites judiciaires (fausse couche spontanée, anomalie congénitale ou décès pouvant être attribué à la toxicité du Percoll). La réaction des professionnels a été variable. Certains ont ignoré cette lettre et continué à utiliser le Percoll en attendant que la commission de sécurité toxicologique (non encore saisie des produits concernant l’AMP) donne son avis. D’autres ont changé de produit et utilisent maintenant Puresperm de Scandinavian IVF Science (colloïde de particules de silice enrobées de silane) ou Spermprep de Medi-cult (colonnes de filtration sur Sephadex) ou encore d’autres préparations commercialisées qui semblent être tout aussi efficaces. Il est important de souligner que le Percoll comprend 2 substances : silice et PVP, et il n’est pas démontré laquelle de ces deux substances poseraient un problème, d’autant que le PVP est utilisé pour ralentir le spermatozoïde avant l’ICSI...

Pour conclure, 1997 est une année charnière dans la prise en compte des risques sanitaires liés à l’utilisation des milieux de culture utilisés en AMP.

La sécurité sanitaire entourant l’AMP est donc devenue une priorité de santé publique vis-à-vis des professionnels, des couples et des enfants à naître.

1. Arora M., Carver-Ward J.A., Jaroudi K., Sieck U., Akhtar M., Is percoll safe for in vivo use ?, Hum. Reprod., 1993, 8, suppl. 1, 96.
1. Menezo Y., Milieu synthétique pour la survie et la maturation des gamètes et pour la culture de l’oeuf fécondé., C.R. Acad. Sc. (D) (Paris), 1967, 282.
1. Nagata Y., Shirakawa K., Setting standards for the levels of endotoxin in the embryo culture media of human in vitro fertilisation and embryo transfer., Fertil. Steril., 1996, 65, 614-619.
1. Scott L., Smith S., Mouse in vitro fertilization, embryo development and viability, and human sperm motility in substances used for human sperm preparation for assisted reproduction., Fertil. Steril., 1997, 67, 372-381.
1. Van Den Bergh M., Baszo I., Biramane J., Bertrand E., Devreker F., Englert Y., Quality control in IVF with mouse bioassays : a four years experience., J. of Assist. Reprod. Genet., 1996, 13, 733.

Contrôles de qualités spécifiques réalisés sur les principaux milieux de culture utilisés en France pour l’AMP.