Place des marqueurs séminaux dans l'évaluation de la fertilité

P.COHEN-BACRIE 1.3.4 A.HAZOUT 1.2.3 S.HAMAMAH 1.2

1.A.R.C.E.F.A.R. (association de recherche clinique et fondamentale appliquée à la reproduction) Paris
2.Unité d'AMP, A.Béclère 157 rue de la Porte Trivaux .92141 Clamart
3.Unité AMP. Muette Eylau .46 rue Nicolo.75116 Paris
4.Laboratoire d'Eylau 55 rue saint Didier 75116 PARIS

L'avènement de la fécondation in vitro (FIV) et particulièrement de la micro injection des spermatozoïdes (ICSI) a mis en exergue des problèmes de sélection des ovocytes à inséminer ou micro injecter mais aussi des spermatozoïdes à traiter avant toute assistance médicale à la procréation (AMP).
En effet une infertilité peut avoir une origine génétique transmissible à l'enfant qui naîtrait de nos techniques d'AMP, mais plus préoccupante est la possibilité de transmissions de pathologies somatiques , d'origine génétique également , associées à l'infertilité (1).
Pour minimiser le risque de transmission d'un handicap sévère à l'embryon des programmes de recherches tendent à mieux appréhender la nature des gamètes utilisées en évaluant des marqueurs de la spermatogénèse et en analysant de manière plus approfondie les éventuelles altérations des chromosomes sexuels (micro délétions de l'Y) mais aussi des autosomes.
Nous aborderons ici la gamme des marqueurs séminaux et testiculaires propres à aider le biologiste ou le clinicien dans sa démarche de sélection des patients à traiter ou à récuser tant le risque d'échec ou d'anomalies éventuelles serait grand.
Les activités testiculaires sont sous contrôle neuro endocrinien ; des actions locales de facteurs de croissances et autres cytokines participent à la spermatogénèse et la stéroïdogénèse (2) (3).
L'équipe clinicobiologique a donc une triple possibilité d'évaluation de la fertilité de l'homme: le plasma sanguin, le plasma séminal et le parenchyme testiculaire.
Le sperme comporte des spermatozoïdes contenus dans un plasma séminal composé de secrétions d'origine épididymaire, vésiculaire, prostatique et bulbo-urétrales. Il est important de souligner que le plasma séminal ne contient pas tous les éléments secrétés au niveau des différentes parties du tractus génital. En effet des réabsorptions notamment testiculaires et épididymaires modifient la nature de l'éjaculat .
Le plasma séminal se constitue au moment de l'éjaculation. Les différentes secrétions ne sont pas émises simultanément. Lors de l'éjaculation, le sphincter lisse de l'urètre se ferme, le plasma épididymaire et les spermatozoïdes en réserve dans la queue de l'épididyme sont émis, entrant ainsi en contact avec la sécrétion prostatique. Il se produit probablement des interactions entre ses trois composants au moment de l'éjaculation. Secondairement le fluide vésiculaire rejoint l'éjaculat. La séquence éjaculatoire se fait en 5 ou 6 parties permettant de récupérer des fractions pures correspondantes aux différentes sécrétions. Il faut noter que tout le matériel sécrété dans les différentes parties du tractus n'est pas incorporé au plasma séminal. Il varie en composition selon les espèces, les individus, avec le moment, l'âge et différents facteurs intercurrents. 100 à 200 protéines ou peptides ont été observés et leur dosage va impliquer obligatoirement, la nécessité de connaître leur origine pour évaluer la contribution relative de chaque compartiment. Ce mélange coagule puis se liquéfie pour constituer un milieu plus ou moins homogène et les interactions enzymatiques permettent l'apparition de substances nouvelles, qui peuvent être biologiquement actives. Le plasma séminal est un milieu en perpétuel évolution. Ce mécanisme complexe s'explique du fait que certains composants actifs sont stockés sous formes de précurseurs, aussi lors d'une nouvelle éjaculation des interactions enzymatiques entraînent l'apparition de substances nouvelles.
Ces phénomènes complexes doivent donc être pris en compte lors de l'évaluation des nombreuses protéines identifiées.

Le plasma séminal est composé :

• de glucides libres et liés (glucose, fructose, sorbitol)
• d' acides organiques (acide citrique, acide ascorbique)
• de substances azotées non protéiques (polyamines, carnitine , cholines)
• de protéines sériques (albumine, immunoglobulines, hormones peptidiques)
• de protéines cellulaires (calmoduline , AMPc)
• de protéines spécifiques (lactoferrine, inhibiteurs de protéases)
• de lipides (prostaglandines, phosphorylcholine, cholestérol , stéroïdes)
• d'enzymes (protéases, glucosidases, phosphatases, transférases)
• de composés minéraux (Zn,Ca,Mg.)
• de facteurs de croissance (TGFa,TGFb,IGFI,IGFII,EGF…)
• de cytokines (IL6,TNFa….)
• de composés organiques retrouvés à des concentrations très élevées qui gèrent en grande partie l'osmolarité du plasma séminal.

Cette grande diversité de composés présents dans le plasma séminal rend compte de la difficulté à rechercher des marqueurs spécifiques de la fonction testiculaire. La période relativement longue durant laquelle s'établit la spermatogénèse, l'interaction de nombreux facteurs hormonaux et de croissance et le dialogue entre de nombreuses cellules d'origines diverses (cellules de Leydig , cellules de Sertoli) ne facilitent pas la tâche des biologistes.
A la différence du système endocrinien , les facteurs de croissance et les cytokines agissent sur leur lieu de production ; ils agissent de façon autocrine mais aussi paracrine. Ces modes de communication sont retrouvés au sein du testicule par exemple entre les cellules de Leydig et de Sertoli mais aussi entre les différentes cellules du tube séminifère.

Les facteurs de croissance et les cytokines ont souvent des analogies structurales mais les systèmes de transduction qu'ils utilisent pour transmettre leur message au noyau et donc aux différents gènes de leurs cellules cibles sont différents.(3)(4)(5)

Ainsi on distingue les facteurs qui exercent leurs actions par l'intermédiaire de récepteurs :

· à tyrosinekinase(EGF,TGFa,FGF,IGF,SCF),
· à sérine-thréoninekinase (TGFb,Activine ,AMH :hormone anti mullérienne).
· d'autres molécules de signalisation peuvent utiliser plusieurs systèmes de transduction intracellulaire (TNFa).
· certains facteurs exercent enfin leur action par le même récepteur et le même système de transduction : EGF,TGFa.

Les molécules sus décrites , ligands et récepteurs, sont présentes sous forme d'ARN messagers et de protéines dans les différents types de cellules testiculaires et à différents stades du développement gonadique.
Certains facteurs sont produits principalement par les cellules somatiques : SCF et AMH par les cellules de Sertoli ; IGF1 par les cellules de Sertoli et de Leydig, d'autres sont exprimés dans les cellules germinales : TNFa,NGF .(6)
D'autres enfin sont exprimés de façon ubiquitaire dans les cellules somatiques et germinales : EGF,TGFa,TGFb.
Dans l'expression spécifique d'un type cellulaire ou d'un stade de développement interviennent des éléments de régulation transcriptionnels et post transcriptionnels (épissage alternatif). Ainsi l'épissage alternatif des pré ARN messagers peut faire apparaître ou non un site de protéolyse qui permet le ciblage d'une molécule (production de SCF soluble ou membranaire).(7)
L'expression de ces facteurs locaux est modulée par les hormones, ce contrôle portant aussi bien sur les ligands que sur les récepteurs.

Les facteurs de croissance et les cytokines jouent un rôle important dans :

· la formation des spermatozoides
· l'acquisition du pouvoir fécondant
· la protection vis à vis du système immunitaire
· l'interaction gamétique.

Le problème du diagnostic est de trouver des paramètres qui peuvent aider les cliniciens ou les biologistes dans leur démarche diagnostique puis éventuellement dans leurs décisions thérapeutiques.

Dans les cas d'oligoasthénospermie plus ou moins sévères , le clinicien ou le biologiste aura tendance à penser qu'à l'heure de l'ICSI il devient aléatoire d'approfondir l'enquête diagnostique. En fait il est toujours utile d'évaluer des paramètres séminaux ou plasmatiques tendant à confirmer les séquelles d'une infection ancienne, la présence d'auto anticorps ,les stigmates biologiques d'une altération progressive de la spermatogénèse ; autant d'arguments qui orienteront une thérapeutique mais aussi inciteront à une auto conservation du sperme avant une dégradation définitive.
Cependant force est de constater qu'aucun paramètre n'est véritablement spécifique de telle ou telle affection et que le plasma séminal en particulier est un mélange de secrétions d'origines diverses ou les activités protéolytiques rendent délicates les évaluations des différents marqueurs que nous allons envisager.

Dans les cas d'azoospermie obstructive l'interprétation est plus aisée du fait de l'occlusion de canaux éjaculateurs qui prive le plasma séminal de certaines secrétions.

Dans les azoospermies non obstructives l'analyse de marqueurs sériques est plus " rentable " tant au point de vue diagnostique que pronostique.
Néanmoins des pathologies associées peuvent brouiller les données biologiques et restaurer l'intérêt d'un examen clinique attentif.

Actuellement des molécules de signalisation peuvent être recherchées à trois niveaux :

- le plasma ou le sérum sanguin
- le plasma séminal
- le tissu testiculaire

1. Dans le plasma sanguin :

En dehors de la FSH premier marqueur de l'état de la spermatogénèse, le taux plasmatique d'Inhibine B est un témoin de la présence et de la sécrétion des cellules de Sertoli . Différentes observations suggèrent l'intérêt majeur de ce marqueur dans le diagnostic différentiel des oligoazoospermies secrétoires ou excrétoires lorsque les taux de FSH ne permettent pas de conclure.(8)
Dans notre expérience ,l'inhibine B est un excellent argument pronostique dans les cas d'azoospermie secrétoire avant un prélèvement éventuel. Si une biopsie testiculaire peut ignorer un foyer de spermatogénèse active, le taux plasmatique d'Inhibine B évalue l'ensemble de l'activité Sertolienne quel que soit son site de production. De fait, un taux élevé d'Inhibine B plasmatique pourrait" réhabiliter " un testicule " condamné "par une biopsie testiculaire négative.

• Un taux plasmatique d'Inhibine B < 30 pg/ml est de très mauvais pronostique et donne à penser que les chances de trouver des spermatozoïdes dans les testicules sont quasiment nulles.
• Un taux compris entre 30 et 110 pg/ml est le témoin d'une activité sertolienne et laisse augurer la présence de spermatozoïdes dans plus de 50% des cas.
• Un taux supérieur à 110 pg/ml donne une quasi certitude de trouver des spermatozoïdes ( 72% des cas dans notre expérience).

Ces critères confirmés par de nombreux auteurs ,ont fait revoir à la baisse les classiques " Syndrome de Sertoli cells only " .
Certains auteurs (Pierick :JCEM 1998) ont montré la décroissance des taux d'Inhibine B plasmatiques dans les cas d'oligoasthénospermie confinant progressivement à l'azoospermie.
D'autres auteurs Anderson 2001 (13) ont confirmé la relation entre inhibine B et spermatogénèse et également un rapport entre qualité du spermatozoïde et taux d'inhibine B

A la différence des hormones, les facteurs de croissance et les cytokines ne sont en principe pas présents dans le sang mais uniquement sur leur site de sécrétion . En réalité ,certains facteurs comme l' IGF1 ou le TGFbêta se comportent aussi comme des hormones ;cependant du fait de leur production dans différents organes ,l'évaluation de leur taux plasmatique ne reflète pas l'activité spécifique du tissu testiculaire.(9)

2. Dans le plasma séminal :

Dans le plasma séminal on retrouve toutes les secrétions ,testiculaires , épididymaires et surtout séminales et prostatiques. Le dosage dans le plasma séminal de nombreuses molécules de signalisation doit tenir compte non seulement des origines multiples mais aussi d'une forte activité protéolytique qui modifie les données techniques (TABLEAU I°).

En effet, lors d'un dosage immunologique, un anticorps donné reconnaît une des séquences polypeptidiques expliquant des variations de résultats importantes .Un anticorps peut aussi reconnaître dans le peptide une ou plusieurs séquences d'acides aminés ne reflétant pas forcément l'activité biologique du peptide.

Comme nous pouvons le constater sur le tableau1 le dosage des cytokines en particulier n'a d'intérêt qu'en cas d'états infectieux ou inflammatoires infra cliniques.
Le dosage des facteurs de croissance n'est pas encore de pratique courante . Pourtant le dosage du TGFbêta et du TNFalpha (que l'on peut considérer comme un facteur de croissance) nous paraissent intéressants pour évaluer la qualité de la spermatogénèse et l'état immunoinflammatoire du tractus génital. (10)

Le groupe des IGF n'est pas interprétable dans le plasma séminal .Le SCF (Stem Cell Factor)
dont l'intérêt est évident pour l'évaluation de la spermatogénèse au niveau du parenchyme testiculaire n'est pas exploitable dans le liquide séminal.

La biochimie séminale traditionnelle reste l'évaluation la plus pratique pour le clinicien.
Il est utile d'en rappeler les données essentielles :

Par rapport au sérum ou au plasma sanguin , les taux sont en général plus élevés sauf pour la phosphatase acide et l'acide urique. l'osmolarité dépend plutôt des composés organiques qu'inorganiques .

Peut-on corréler les taux de ces facteurs avec les différentes étiologies des oligo et azoospermies? Des précautions doivent être prises quant à l'origine testiculaire ou extra-testiculaire et quant aux types de dosages utilisés (RIA, ELISA, bio activité). Aussi, les dosages utilisés doivent tenir compte de la nature protéique des facteurs de croissance et des cytokines. En effet, un anticorps donné (dans un dosage immunologique donné) reconnaît une (des) séquence(s) polypeptidique(s), ce qui peut expliquer des variations de résultats importantes entre les différents kits (c'est-à-dire les différents anticorps) du commerce. Par ailleurs, un anticorps reconnaît dans le peptide une (des) séquence(s) d'acides aminés qui ne reflète pas forcément l'activité biologique de ce peptide. Dans ces cas, seuls des dosages de bio activité (utilisant par exemple des lignées cellulaires avec un marqueur spécifique du peptide étudié) ou un dosage par radio-récepteur peuvent valider le dosage immunologique. Cette approche devrait ainsi permettre de sélectionner parmi les kits du commerce (qui sont de plus en plus nombreux), ceux qui donnent des valeurs les plus proches de celles du dosage biologique.
Quelques travaux rapportent des variations du taux des facteurs de croissance et des cytokines dans le plasma séminal de patients stériles. Pour la grande majorité de ces facteurs, et en particulier pour les cytokines, il semble que leurs taux varient en fonction de l'état infectieux du tractus génital. En ce qui concerne les facteurs de croissance, les travaux sont encore rares et seules des précautions minutieuses devraient permettre d'utiliser ces molécules comme marqueur de l'état fonctionnel de la spermatogenèse
Certaines anomalies peuvent être mixtes ,associées ou non à un état inflammatoire ; l'interprétation des résultats est alors très délicate .L'examen clinique trouve dans ces cas à nouveau toute sa place.
Le dosage des marqueurs épididymaires permet aussi le suivi post opératoire des anastomoses épididymo-déférentielles.
Retenons surtout que compte tenu des difficultés d'interprétation liées à l'infection souvent infra clinique (35% des hommes seraient atteints de prostatite chronique), la biochimie séminale est surtout utile pour compléter les données d'un bon examen clinique et échographique.

3. Dans le testicule :

Les deux fonctions majeures du testicule sont de produire des androgènes et des spermatozoïdes .La croissance ,la différenciation et la mort programmée des cellules testiculaires sont sous le contrôle de facteurs de croissance et cytokines à des différents stades du développement gonadique.
Les facteurs de croissances ont des caractéristiques particulières :
- l'activité de chaque facteur dépend de la présence des autres.
- ces facteurs peuvent être secrétés sous une forme inactive.(ex :la famille des TGFb avec leurs protéines transporteuses ,les IGF avec leurs récepteurs solubles ,le TNFa
ou le récepteur à l'antagoniste de l'IL1).

Quels facteurs de croissance sont impliqués dans le développement et la fonction du testicule ?:

- les IGFs , le TGFb , le couple TGFa/EGF, le bNGF , le FGF (2) (11)(12)
- les cytokines incluant le très important système c-kit/SCF (Stem Cell Factor),les interleukines 1 et 6 et le TNFa .
Nous savons aujourd'hui qu'il existe un système IGF1 intra testiculaire complet avec ligands, récepteurs et protéines transporteuses sans lequel la spermatogénèse ne serait pas normale. L'action de IGF1 est potentialisée par LH et FSH et réduite par TGFbêta , IL1alpha , et le TNFa.IGF1 est exprimé et dosable dans les cellules de Sertoli et les cellules de Leydig .
Il existe une corrélation nette entre la présence de ce système IGF1 et celle de spermatocytes et spermatides dans le testicule .

Le TGFbêta a été identifié dans le testicule à différents stades de son développement . Il exerce une action inhibitrice de la prolifération et surtout de la différenciation cellulaire contrairement au rôle exercé ailleurs(12). Au niveau des cellules de Leydig il réduit la biosynthèse hormonale .
Au contraire du TGFa localisé exclusivement dans les cellules somatiques l'EGF a été détecté dans les cellules somatiques mais aussi germinales. Des récepteurs de l'EGF ont été identifiés dans la région post acrosomiale du spermatozoïde humain, dans l'épididyme et dans les canaux déférents.

Les cytokines tels l'IL1 stimulent le développement des cellules germinales . IL1 participe à la prolifération des cellules de Leydig. Le TNFa est présent dans le testicule ; il est produit par les spermatocytes et spermatides. Il y a des récepteurs au TNF dans les cellules de Sertoli et de Leydig . Le TNF a un effet délétère sur la fonction testiculaire et sa présence excessive témoigne de phénomènes infectieux ou immunoinflammatoire même infra cliniques.
Les deux facteurs SCF (secrété par les cellules de Sertoli) et son récepteur (c-kit secrété par les spermatogonies A) ne sont pas détectables dans le parenchyme testiculaire en l'absence de spermatogénèse.(7)
Le système SCF c-kit pourrait jouer un rôle crucial dans la prolifération et la migration des cellules germinales.
L'action des facteurs de croissance et des cytokines dans le testicule n'est pas clairement définie mais des données expérimentales de transgénèse (Knock out ou surexpression) montrent qu'une expression inadéquate de facteurs de croissance ou des cytokines peut aboutir à la stérilité (TABLEAU II).

Le tissu testiculaire offre les possibilités les plus intéressantes pour identifier différentes anomalies entraînant des pertes de fonction du ligand, du récepteur, du système de transduction ou des facteurs de transcription utilisés par les facteurs locaux pour contrôler l'expression de leurs gènes cibles.

CONCLUSION

En combinant les données des dosages plasmatiques d'INHIBINE B, de FSH et les paramètres séminaux sus décrits et en dernière analyse l'exploration du couple SCF/c-kit (pré méiotique) et le système TGFb (post méiotique) il est désormais théoriquement possible de fixer le niveau du trouble de la spermatogénèse.
Dans un avenir proche le recours à la biopsie testiculaire devrait être étayé par ces analyses biologiques au point d'offrir plus de possibilités thérapeutiques et diagnostiques . Ainsi on connaîtra moins de biopsies testiculaires " blanches " et d'explorations parenchymateuses inutiles ceci souligne l'intérêt majeur de l'étude de ces marqueurs séminaux.

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TABLEAU I

TABLEAU II