Méthodes pour l'obtention des Blastocystes in vitro
Yves Ménézo*1, Chouteau J.*2,
Girard A., Sage JC*2, Nicollet*1
*1 Laboratoire de cytogénétique et de Procréation médicalement
assistée. Laboratoire Marcel Mérieux, 1 Rue laborde BRON France
*2 Clinique Belledone, Grenoble
INTRODUCTION
Le but de la Fécondation in vitro et de la culture
embryonnaire est de fournir des embryons haute qualité capable de continuer leur
développement, de réaliser leur implantation, pour finalement donner des descendants
viables. Depuis les premières études sur les cultures d'embryons, des progrès
considérables ont été réalisés. Avec d'autres, (Tervit et al. 1972), nous avons
débuté dans les années 70 ,la réalisation de milieux complexes basés sur les
sécrétions génitales femelles. Malgré ces efforts, des retards de développement
apparaissent toujours in vitro (Humain:Bolton et al. 1989). Ceci amène à des arrêts de
développement au moment de la mise en route du génome embryonnaire (Poueymiriou et al.
1989). Avant la mise en route du génome embryonnaire, il n'y a en effet pas (ou très
peu) d'activité transcriptionnelle. Aussi, à la fin de la maturation, l'ovocyte doit
contenir les ARN messagers et les protéines nécessaires aux premières étapes de
développement i.e les systèmes métaboliques nécessaires et au bon équilibre.
De plus, le cycle pendant lequel démarre
l'activation génômique est le cycle le plus long du développement
préimplantatoire.
Tout retard à ce moment se traduira par un blocage
du fait d'une chute des réserves en deçà d'un seuil critique. Il est dorénavant connu
que la composition des milieux de culture a un impact sur les activité transcritionnelles
et traductionnelles de l'embryon (Ho et al. 1994, Jung 1989). Le métabolisme embryonnaire
est ralenti in vitro alors que le turnover des protéines est au contraire accéléré.
Une diminution sévère de la viabilité (Bolton et al. 1989, Bowman et Mc Laren 1970) ,
et un nombre de cellules anormalement bas (Human: Vlad et al; 1996) est aussi observé.
L'impact d'un nombre trop faible de cellules est évident: au moment de l'éclosion, ce
sont les lysines de cellules du trophecoderme qui entame la dégradation de la zone
pellucide. C'est la formation chronologiquement et morphologiquement normale du
blastocyste qui est le meilleur indicateur de la qualité embryonnaire. La détermination
finale étant le grossesse après transfert.
Il y a, de toute évidence, des changements
dynamiques dans l'environnement embryonnaire lors de son transit dans les voies génitales
femelles (Rousseau et Ménézo 1993). Deux solutions sont proposées pour
"coller"aux besoins embryonnaires: des changements séquentiels de milieux ou un
changement dynamique du milieu de culture par l'utilisation de tapis cellulaires
(cocultures). Nous avons essayé ici de prendre en compte les études validées par des
transferts embryonnaires, ce qui est rarement le cas.
Cocultures:
Les cultures organotypiques de l'embryon dans
l'oviducte,ont constitué les premières cocultures embryonnaires. Elles étaient bien
sûr basées sur les interactions paracrines (Biggers et al. 1962). Il a été alors
successivement démontré que le priming hormonal de l'oviducte n'est pas nécessaire,
puis que l'origine génitale des cellules n'était pas nécessaire. (Camous et al. 1984,
Ménézo et al. 1990).
La technique de coculture diffère totalement de la
culture embryonnaire classique. Le choix du milieu est capital: il a à satisfaire aux
besoins de l'embryon et du tapis cellulaire. Des effets faux positifs et des faux
négatifs sont directement liés au milieu de culture (Xu et al. 1992). Dans le même
ordre d'idée, la présentation des cellules (suspension, tapis à confluence ou non)
interfère avec les résultats. Les embryons cocultivés ont toujours un nombre de
cellules plus important que les embryons cultivés en milieux seuls (Vlad et al. 1996,
Goodeaux et al. 1989). Deux expérimentations récentes ont montré l'importance des
facteurs techniques (Vlad et al. 1996, Van Blerkom 1993, Tableau 1).En association avec le
nombre de cellules, la quantité de matière sèche est également plus importante en cas
de coculture(Turner et al. 1994).
Un aspect important dans le compréhension des
effets de la coculture est l'interaction avec les voies métaboliques. S'il y a des
déficits dans le stockage des enzymes et des ARN messagers dans l'embryon, il peut se
produire des "culs de sacs" du fait de l'impossibilité de métaboliser certains
composés. Il se produit une perte d'énergie associée à l'accumulation de composés
inutiles. Un bon exemple est celui du métabolisme du glucose In vitro, dans les milieux
trop simples, le glucose conduit à l'accumulation du glycogène; ceci ne se produit ni in
vivo , ni in vitro en coculture (Khurana and Wales 1987). Ceci ne peut être expliqué par
une chute de la concentration en glucose du fait du métabolisme des cellules (Ouhibi et
al. 1990). Plus vraisemblablement, le tapis cellulaire fournit, du fait de son propre
métabolisme, des petites molécules permettant à la machinerie cellulaire de l'embryon
de fonctionner avec un maximum d'efficacité. Le glucose est de fait nécessaire pour les
embryons précoces. De façon évidente le glucose et la glutaine sont présents dans
l'environnement embryonnaire durant son transit dans les voies génitales femelles
(Rousseau and Ménézo 1993). Les cellules du tapis cellulaire contribuent également à
optimiser le niveau d'acides aminés. Elles contribuent à un potentiel red-Ox réducteur:
par la synthèse et le relargage de composés réducteurs comme le glutathion et
l'hypotaurine, qui est un effecteur important du développement embryonnaire précoce
(Barnett and Bavister 1992). Une enzyme spécifique (la cystéine sulfinate
décarboxylase) est responsable de la synthèse d'hypotaurine dans l'environnement
tubaire.Ces agents réducteurs ont également des effets antiradicalaires. Il préviennent
la peroxydation des lipides et d'autres composés comme cystéine et méthionine.
Le catabolisme des aminoacides peut rendre le milieu
toxique du fait de l'accumulation d'ammoniac, quand la culture est réalisée sous huile.
In vivo, ou en coculture, l'ammoniac est recyclé par voie enzymatique (Ménézo et al.
1993, Lane and Gardner 1995), avec formation d'alanine, d'acide aspartique/ asparargine et
d'acide glutamique/glutamine.
La présence de facteurs embryotrophiques
spécifiques dans les voies génitales femelles est improbable. Une ubiquité est plus
probable. (Paria and Dey 1990). Des facteurs de croissance et leurs récepteurs sont
présents dans l'embryon (Adamson 1993, (Watson et al. 1992)). Les facteurs de croissance
sont des candidats potentiels aux effets autocrines. Cependant il est probable que
l'embryon n'est pas capable d'utiliser ses propres facteurs de croissance "en
boucle". Par contre, la culture des embryons en groupe permettrait des interactions
positives d'embryon à embryon.. Chia et al (1993) ont démontré la nécessité d'un
apport exogène (paracrine) de facteurs de croissance, notamment EGF, chez l'homme. En
effet , il existe une extinction provisoire de ce facteur et de son récepteur dans le
trophectoderme. Les cellules Vero et MDBK sécrètent en permanence EGF; ce n'est pas le
cas des cellules de l'oviducte de certaines espèces. Thibodeaux et al. (1993) ont montré
que les facteurs de croissance agissent en synergie. Si une voie est bloquée, un autre
facteur de croissance pourra stimuler l'embryon.
Les cellules de l'utérus (et les cellules Vero)
secrètent du LIF (leukemia inhibitory factor), qui stimulent le développement et
l'implantation du blastocyste de Souris (Kauma and Matt 1995). Rien n'a été démontré
quant au rôle du LIF chez l'homme.
Les milieux séquentiels
Les progrès apportés par la coculture et en
général par une meilleure connaissance de la biochimie de l'embryon ont poussé les
systèmes de culture sans coculture. De fait, il y avait un besoin de changer à la fois
de formules et de concepts, pour "suivre" au plus prés les besoins de
l'embryon, d'abord avant l'activation génômique puis après. Il est maintenant évident
que les aminoacides sont nécessaires dès la fécondation. Ils sont même nécessaires
pour des manipulations de courte durée de l'embryon. L'utilisation d'une teneur en C02 de
5% peut favoriser la formation des Blastocystes. C'est plutôt une trop forte
concentration externe en glucose dans un milieu trop simple qui rend le milieu inadéquat,
plutôt que le glucose per se. Ali et al. (1993), de même que Gardner et Lane (1996)
n'ont pu démontrer aucun effet toxique du glucose quand de la glutamine et d'autres
aminoacides sont ajoutés dans le milieu de culture. L'idée d'enlever le glucose et les
phosphates du milieu de culture ne semble pas physiologique, mais ceci est le cas de
quelques milieux de culture commerciaux.(Quinn 1997). Au contraire, le pyruvate est un
composé doublement intéressant: c'est une source d'énergie majeure pour les embryons
aux stades précoces et un facteur de detoxyfication de l'ammoniac par transamination,
formation d'alanine et re-export de l'alanine formée (fig 1). La glycine est l'acide
aminé majeur des sécrétions génitales femelles: il est immédiatement catabolisé en
Glycollate et glyoxyllate (Khatchadourian et al. 1994) avec perte d'ammoniac. La glycine
agit en synergie avec la taurine et la glutamine. Dans les milieux séquentiels, la
formation d'ammoniac impose de changer les milieux au moins tous les 2 jours, si la
culture est réalisée sous huile. Dans l'état actuel des connaissances, l'albumine est
encore nécessaire dans les milieux de culture.
EDTA est ajouté pour la culture des stades
précoces: il sert d'agent antiradicalaire par "piegeage" des ions Fe et Cu. L'
EDTA serait délétère après l'activation génômique et doit donc être éliminé dans
la seconde phase de culture (Gardner et Lane 1996).
Les facteurs de croissance sont présents dans les
milieux de culture après activation génômique. Insuline du fait de son action sur le
métabolisme protéique et EGF sont des effecteurs importants. Cependant, la composition
des milieux de culture est dorénavant tenue de plus en plus confidentielle, ce qui
interdit une analyse plus poussée des interactions.
Analyse comparée des "séquentiels" et de
la coculture
Il est clair qu'au vu des derniers résultats sur
les milieux séquentiels (Voir Gardner 1997, Chouteau et al. 1997), ils ont dorénavant
acquis une place prépondérante. Par contre, il est toujours vrai que les facteurs
paternels et maternels peuvent interférer avec les résultats obtenus.
La formation de blastocyste est voisine de 50% en
séquentiels comme en coculture.Sur les 50% des embryons bloqués en culture, la moitié
l'est pour des raisons cytogénétiques (Benkhalifa et al. 1996). Le tableau 2 donne les
résultats comparés.
CONCLUSION
Les succès assez faibles obtenus en culture
embryonnaire (surtout de longue durée) a longtemps compromis l'essor des biotechnologies
liées à la reproduction. Dans un premier temps, la coculture a permis de résoudre une
partie de ces problèmes: maintien de la qualité embryonnaire après culture prolongée
avec des taux d'implantation satisfaisants après transfert (Bongso et al. 1991, Freeman
et al. 1995). Elle permet de plus une sélection cytogénétique des embryons (Benkhalifa
et al. 1996). Enfin, la capacité à subir le processus de congélation/décongélation
est bonne.
L'approche empirique pour définir de nouveaux
milieux de culture a été un échec jusqu'au moment où les connaissances ont permis de
mieux comprendre les interactions entre les embryons et le milieu. C'est l'abandon de
l'idée qu'un milieu simple seul pouvait permettre d'obtenir des Blastocystes avec un
rendement correct qui a également fait avancer les concepts. Dorénavant l'utilisation de
milieux séquentiels semble efficace; il reste cependant à déterminer leur efficacité
réelle sur un plus grand nombre de patientes et déterminer leur impact sur les enfants
nés. Enfin, l'aptitude à supporter la congélation doit également être définie.
Il semble néanmoins évident que le transfert au
stade blastocyste ne devrait plus être l'exception mais la règle.
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Table1: Nombre de cellules des blastocystes
humains en fonction du type de culture
Tableau 2: Formation et qualité des blastocystes en fonction des techniques de culture
utilisées.
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