Maturation des cellules souches de la lignée spermatique

Les progrès récents en matière de micromanipulation cellulaire ont rendu possible la fécondation de l’ovocyte humain avec des cellules immatures de la lignée spermatique qui ne correspondent pas exactement à la définition "classique" du gamète mâle. Cependant, seules les cellules postméiotiques de la spermatogénèse - les spermatides - ont été utilisées avec succès pour le traitement de l’infertilité. Alors que le taux de réussite actuel de la procréation médicalement assistée (PMA) avec spermatides reste relativement faible, une grande partie des hommes avec arrêt de spermatogénèse ne produisent même pas de spermatides et le développement de leurs cellules précurseurs reste bloqué aux stades précédents, le plus souvent au stade de spermatocyte primaire. La culture des cellules souches de la lignée spermatique a été testée dans deux buts : premièrement, améliorer les taux de succès de la reproduction assistée avec spermatides et deuxièmement, tenter de débloquer la division méiotique chez les patients avec arrêt de spermatogénèse au stade de spermatocyte primaire et obtenir ainsi des spermatides qui pourraient ensuite être utilisées pour féconder l’ovocyte.

Parmi les exigences fondamentales pour l’exercice de la fonction de gamète (Tableau 1), la présence d’un complément haploïde de chromosomes est indispensable. Pour la fécondation naturelle, ce matériel doit être empaqueté dans une structure supramoléculaire unique et non nucléosomique qui contient des protéines basiques spécifiques pour le spermatozoïde - les protamines. Ces protéines remplacent les histones pendant la phase finale de la spermatogénèse. Cet arrangement particulier de la chromatine sert à minimiser le volume du noyau afin que le spermatozoïde puisse le transporter à l’intérieur de l’ovocyte en utilisant le moins d’énergie possible. Néanmoins, des études récentes ont montré que l’empaquetage de la chromatine n’est pas une condition nécessaire pour la fécondation lorsque le noyau mâle est introduit en force dans l’ovocyte par micromanipulation. En effet, des fécondations normales, suivies par un développement embryonnaire jusqu’au terme, ont été établies chez la souris (1-3) et chez l’homme après le transfert des cellules spermatogéniques (ou leurs noyaux isolés) qui n’ont pas encore entamé le processus de l’empaquetage nucléaire. En revanche, les noyaux des cellules spermatogéniques immatures sont bien plus sensibles aux effets de différents facteurs ooplasmiques qui peuvent les influencer aux moments non désirés. C’est ainsi que le noyau d’une spermatide, injecté dans un ovocyte mature (métaphase II) tout en évitant l’activation ovocytaire, est transformé rapidement en configuration métaphasique (7), à la différence du noyau d’un spermatozoïde mature qui, en absence d’activation ovocytaire, n’entre pas en métaphase pendant plusieurs heures (8). Une entrée prématurée en métaphase peut compromettre la fécondation après l’injection intra-ovocytaire de spermatides chez la souris (2), bien que certains de ces ovocytes puissent être récupérés pour un développement apparemment normal par l’activation artificielle appliquée plus tard (7).

Outre le complément chromosomique haploïde, le gamète mâle doit comporter aussi plusieurs facteurs epigénétiques (Tableau 1) dont l’empreinte paternelle sur certains gènes semble d’une importance particulière (9, 10). En revanche, l’importance du centriole spermatique, fonctionnant comme un centre d’organisation de microtubules, est dépendante de l’espèce, puisque les microtubules du zygote sont organisés à partir des centres provenant de l’ovocyte plutôt que de ceux en provenance du spermatozoïde chez au moins deux espèces de rongeurs (souris et hamster), et même dans d’autres espèces de mammifères, chez lesquels cette fonction doit normalement être servie par le centriole spermatique, elle peut être reprise, dans certaines conditions, par les structures ovocytaires (11, 12).

Quant au facteur du spermatozoïde responsable de l’activation ovocytaire (Tableau 1), dont les caractéristiques moléculaires restent toujours à découvrir (13), sa fonction pourrait aussi être contournée. Bien que la manière physiologique de déclencher l’activation ovocytaire, caractérisée par des augmentations répétées de la concentration cytosolique de calcium, facilitées par le facteur du spermatozoïde, reste de loin le mode le plus efficace pour obtenir des embryons normaux, des traitement alternatifs, utilisant des agents pharmacologiques qui agissent sur les stocks intraovocytaires de calcium ou sur l’activité de protéine kinases et phosphatases, peuvent aussi conduire à la formation d’embryons normaux (13, 14).

La spermatogénèse humaine peut être arrêtée par un processus pathologique à différentes étapes de son déroulement (15), ce qui a pour conséquence une accumulation de cellules souches immatures dans les tubules séminifères. Dans les cas où la spermatogénèse est bloquée après la méiose, les spermatides rondes peuvent être utilisées pour la PMA (4), bien que l’efficacité, en terme de la probabilité d’une naissance par tentative, reste relativement faible (10). La majorité des échecs de PMA après injection de spermatides rondes dans les ovocytes (ROSI) est liée au fait qu’une grande partie des spermatides qui peuvent être obtenues chez les sujets atteints par des testiculopathies sévères porte des lésions irréparables de son ADN, dues au processus d’apoptose (mort cellulaire programmée) (16). Or, l’arrêt postméiotique de la spermatogénèse est une condition relativement rare. Dans la plupart de cas, la spermatogénèse est bloquée dans la prophase de la première division méiotique, au stade de spermatocyte primaire (15). Nous avons montré récemment qu’il est possible, dans certains cas, de réactiver la spermatogénèse ainsi bloquée pendant la culture in vitro de cellules explantées du testicule (17) et que les spermatides résultant de la culture in vitro peuvent être utilisées avec succès pour la PMA (18).

Des études récentes montrent que des cellules précoces de la lignée spermatique humaine (spermatocytes primaires) peuvent accomplir la séquence de transformations caractérisant les deux divisions méiotiques pendant la culture in vitro des tubules séminifères partiellement désintégrés dans les milieux contenant des concentrations élevées de FSH et de testostérone, et ceci à une vitesse largement supérieure par rapport à la situation in vivo (17, 19). Une pareille accélération du développement de cellules spermatogéniques a été aussi achevée chez certains patients souffrant de l’arrêt de la spermatogénèse au stade de spermatocyte primaire (18). Dans une autre étude, les noyaux de spermatocytes secondaires ont été forcés dans une métaphase prémature après son injection dans des ovocytes humains en métaphase II, et au moins un embryon résultant de cette opération était viable (20). Ces données (Tableau 2) soulèvent des interrogations quant aux conséquences génétiques potentielles pour les enfants ainsi conçus, le risque d’erreurs au cours de la ségrégation successive des chromosomes et des chromatides pendant les deux divisions méiotiques étant le plus souvent cité. Pour évaluer l’importance de ce risque, il est nécessaire d’analyser les données expérimentales qui ont permis de découvrir les mécanismes de contrôle de la méiose mâle et de la spermiogénèse et la relation entre les deux niveaux de contrôle cellulaire.

La formation du gamète mâle à partir de ses cellules précurseurs diploïdes prend plusieurs semaines chez les mammifères (plus de deux mois chez l’homme). La longueur de ce processus est au moins partiellement due à l’existence de mécanisme de contrôle (checkpoints) qui agissent aux plusieurs étapes du processus. Il s’agit des arrêts réversibles du développement pendant lesquels la cellule met en œuvre des mécanismes qui déterminent si les étapes antérieures ont été complètement achevées. L’absence d’anomalies détectées pendant ces contrôles est une condition nécessaire pour que le développement de la cellule contrôlée soit débloqué, alors que les cellules trouvées imparfaites restent bloquées et, si l’anomalie n’est pas réparée prochainement, elles sont ensuite éliminées par le processus de la mort cellulaire programmée (apoptose). L’un de checkpoints principaux contrôlant la spermatogénèse se situe à l’entrée des cellules souches dans la première métaphase méiotique, au stade de pachytène de la première prophase (spermatocytes primaires). A ce moment la cellule contrôle si le processus de recombinaison, dont la contrepartie morphologique est la formation des synapses sur les chromosomes, est complet. C’est ainsi que la transition entre les stades pachytène et métaphase dure environ une semaine in vivo mais cette durée peut être raccourcie considérablement (quelques heures) en culture in vitro si le mécanisme de contrôle correspondant est supprimé par l’addition dans le milieu de culture de l’acide okadaique, un inhibiteur de phosphatase (19, 21). L’inhibition de phosphatase a pour conséquence une activation artificielle (par phosphorylation) de la substance active du facteur promouvant la métaphase (métaphase promoting factor, MPF). Le même effet peut être obtenu par l’injection des noyaux de spermatocytes primaires dans les ovocytes au stade de métaphase II qui contiennent spontanément une haute activité de MPF (22). Il est cependant probable que l’entrée de spermatocytes primaires dans la métaphase est aussi contrôlée par un mécanisme indépendant de celui concernant la recombinaison (23). Ce dernier mécanisme pourrait contrôler l’assemblée des macromolécules (ARN messager et protéines) qui doivent être stockées pendant toute la période des divisions méiotiques pour être utilisées ensuite dans le processus de la différentiation postmeiotique des cellules spermatogéniques (Tableau 3). La logique biologique d’un tel mécanisme serait d’éviter le gaspillage inutile des ressources des tubules séminifères pour faire progresser les cellules qui ne pourraient jamais achever leur développement et former un gamète doté d’un pouvoir fécondant autonome.

L’exposition de segments explantés des tubules séminifères aux concentrations élevées de FSH et de testostérone (17), condition nécessaire pour surmonter l’arrêt pathologique de la spermatogénèse in vivo et pour permettre la reprise de la spermatogénèse in vitro (18), mène aussi à une accélération spectaculaire de certaines phases clés de la différentiation méiotique et postméiotique (17, 18). Cette observation a soulevé des inquiétudes quant à la régularité de la ségrégation des chromosomes et des chromatides pendant ces divisions. Ces inquiétudes étaient renforcées par les études démontrant l’efficacité très basse de la fécondation avec spermatocytes primaires chez la souris (22, 24). Dans ce dernier modèle, les noyaux de spermatocytes primaires sont amenés à subir deux cycles de division sans réplication d’ADN intercalée par injection de ces noyaux d’abord dans un ovocyte immature (stade de vésicule germinale) qui traite ces noyaux intrus de la même manière que son propre noyau lorsqu’il entre en métaphase et en anaphase de la première division méiotique ; après cette première réduction les chromosomes provenant du spermatocyte sont retirés par micromanipulation et réinjectés dans un ovocyte mature (métaphase II) qui effectue la deuxième réduction au moment de l’activation provoquée par une décharge électrique (24). Alternativement, les deux divisions rédactionnelles du noyau de spermatocyte primaire ont été aussi achevées par l’injection séquentielle du noyau dans deux ovocytes matures suivies par l’électroactivation (22). Dans les deux situations expérimentales, les activités élevées de MPF qui maintiennent les chromosomes de l’ovocyte en métaphase font rapidement entrer le noyau du spermatocyte en métaphase aussi. Le matériel génétique provenant du spermatocyte est ensuite reparti, au cours de l’anaphase, entre l’ovocyte lui-même et une petite cellule qui ressemble au corpuscule polaire (pseudo corpuscule polaire). Ceci a lieu lorsque l’activité de MPF tombe brusquement entre la première et la deuxième division méiotique de l’ovocyte ou après l’activation ovocytaire. Cependant, cette méthode de réduction artificielle de chromosomes est souvent à l’origine d’erreurs de ségrégation des chromosomes et des chromatides, notamment lorsque deux ovocytes matures sont utilisés (25). Ces erreurs ont pour conséquence des anomalies chromosomiques numériques et structurelles des embryons résultant de ces manipulations, puisque le cytoplasme ovocytaire semble manquer de mécanismes de correction qui pourraient réparer ces irrégularités (26).

Par rapport aux techniques utilisant l’ovocyte pour réduire le matériel génétique des spermatocytes primaires, la méthode utilisant la culture in vitro de segments des tubules séminifères (17) semble provoquer moins d’irrégularités dans le processus de ségrégation chromosomique (Tableau 3). Nos observations préalables suggèrent que seuls les spermatocytes primaires qui se trouvent dans une période avancée de stade pachytène peuvent être recrutés pour entrer en métaphase accélérée, ce qui semble indiquer que le mécanisme naturel contrôlant l’achèvement de la recombinaison reste actif dans ce système (27). En revanche, l’accélération de la transition entre les phases G2 et M du cycle cellulaire dans ce système pourrait être liée à l’abolition d’un autre mécanisme de contrôle, peut-être celui qui est supposé vérifier l’achèvement de l’accumulation des molécules nécessaires pour la spermiogénèse (Tableau 3). Cette hypothèse, qui reste à tester d’une façon contrôlée, est fondée sur l’observation que des formes atypiques prévalent parmi les spermatides issues de la culture in vitro des spermatocytes primaires (17). En tous cas, les données disponibles n’indiquent pas un risque inacceptable d’anomalies chromosomiques liées à la différentiation transméiotique in vitro des cellules souches de la lignée spermatique humaine, et le caryotype des deux premiers enfants nés après l’utilisation clinique de cette technique est normal (27).

La maturation in vitro des cellules souches de la lignée spermatique est une des approches récemment proposées pour surmonter l’arrêt de la spermatogénèse dû à des testiculopathies sévères. En même temps, c’est la seule méthode qui a été déjà appliquée avec succès en PMA. La plupart des études réalisées chez les animaux utilisaient des techniques alternatives, fondées sur l’haploidisation des spermatocytes par action de facteurs ovocytaires, après injection dans des ovocytes aux différents stades de maturation. Ces techniques étaient invalidées par une fréquence très élevée d’anomalies chromosomiques, résultant d’une répartition irrégulière des chromosomes et des chromatides provenant du spermatocyte au cours de l’haploidisation forcée dans le cytoplasme ovocytaire. En revanche, la plupart des spermatides issues de la maturation des cellules souches in vitro ne portent pas d’anomalies chromosomiques et la fécondation avec ces cellules ont déjà donné des embryons viables et des naissances d’enfants avec caryotype normal.

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Tableau 1. Aspects caractérisant la fonction du gamète mâle

Aspects génétiquesAspects epigénétiques

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Nombre haploide de chromosomesEmpreinte paternelle sur certains gènes

Région organisatrice de microtubules

Facteur activateur d’ovocyte

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Tableau 2. Méthodes de PMA utilisant la production artificielle des gamètes humains masculins

Indication cliniqueMéthodeNaissanceRéférence

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Arrèt postmeiotiqueSpermatogénèse in vitroOui18

de la spermatogénèse (spermatide)

Arrèt meiotique précoce de laSpermatogénèse in vitroOui 18

spermatogénèse (spermatocyte I)

Arrèt meiotique tardif de laHaploidisation nucléaireOui20

spermatogénèse (spermatocyte II) dans l’ovocyte mature

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Tableau 3. Mécanismes développementaux (checkpoints) contrôlant la spermatogénèse humaine et leur activité dans différents systèmes in vitro

Caractéristique du checkpoint Activité du checkpoint dans différents systèmes in vitro

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Processus controlé Stade Ovocyte mature Ovocyte immature Tissu testiculaire en culture

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Achèvement Pachytene Absente Non connue Présente

de recombinaison

Maturité Pachytene Absente Absente Absente

cytoplasmique

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