P. CLEMENT, P. COHEN–BACRIE

Laboratoire Clément, 8 avenue Henri Barbusse, 93 150 Le Blanc Mesnil
Laboratoire d’Eylau, 55 rue Saint Didier, 75 116 Paris

Depuis les publications des différentes lois et décrets d’application parus au Journal Officiel la qualité apportée aux actes d’AMP a nettement été renforcée. Les aspects biologiques de l’assurance de qualité en AMP font l’objet de ce travail.

Tout dossier d’assistance médicale à la procréation (AMP) doit être étudié en réunion pluridisciplinaire clinico-biologique avant tout acte d’AMP.
Ces réunions doivent être régulières, planifiées. Elles sont le lieu d’échanges privilégiés entre les différents acteurs des actes d’AMP. Elles permettent une confrontation des données cliniques, biologiques, et psychologiques.

Des comptes rendus de ces réunions pluridisciplinaires doivent être faits et conservés dans un registre, pendant 3 ans. Pour chaque couple la décision prise au moment de la réunion doit être notée dans ce registre.

Le couple doit être informé de l’étude de son dossier à la réunion pluridisciplinaire, en lui précisant la décision qui a été prise.

Pour chaque acte d’AMP, une fiche clinique complète doit être remplie par le clinicien, à l’attention du biologiste.

Une consultation avec le biologiste doit être proposée au couple par le clinicien.
Cette consultation permet une rencontre entre le biologiste et les deux membres du couple avec :

• Vérification de l’ensemble des papiers administratifs demandés en cas d’AMP
• Une explication des données biologiques pour lesquelles les couples sont souvent demandeurs, notamment les techniques particulières comme la micro-injection ou la culture prolongée ou l’éclosion assistée.
• Une nouvelle vérification de la motivation du projet parental.

Les actes d’AMP sont soumis à la signature par le couple de différents consentements :

• Demande d’AMP à chaque tentative.
• Demande de congélation et de décongélation des embryons.
• Information sur les techniques particulières : ICSI, culture prolongée, hatching.

1.4 Contrôle de l’identité des couples.

Au moment de chaque tentative d’AMP, l’identité des deux membres du couple doit être vérifiée, par le contrôle des pièces d’identité.
Des photocopies des cartes d’identité, du livret de famille, du certificat de concubinage ou du certificat de vie commune de plus de 2 ans doivent être conservées dans le dossier.

1.5 Mesures d’hygiènes

Dans le cadre des précautions universelles à respecter dans les laboratoires travaillant avec des prélèvements humains ( CDC d’ATLANTA : MMWR n°2 Spécial 1987 ) plusieurs mesures sont à prendre en compte :

• Port de gants, à changer entre 2 patients.
• Port de masque.
• Procédure de lavage des mains.
• Procédure de lavage de la peau en cas de projection.
• Prévention des blessures et des coupures.

Un nettoyage efficace et quotidien des locaux et des paillasses doit être réalisé selon des procédures écrites et validées.
Des fiches de nettoyage doivent être quotidiennement remplies par la personne s’occupant du nettoyage des locaux.
L’ensemble du personnel du laboratoire doit être vacciné contre le virus de l’hépatite B.

1.6 Tests de sécurité sanitaire

Un bilan sérologique de chaque membre du couple datant de moins d’un an doit être disponible dans le dossier.
Les tests sérologiques à faire sont :

• Sérologie d’hépatite B.
• Sérologie d’hépatite C.
• Sérologie HIV 1 et 2.
• Sérologie syphilis.

1.7 Traitement des gamètes et des embryons.

L’ensemble du travail effectué en AMP doit être effectué en atmosphère stérile :

• Travail sous hotte à flux laminaire ( de préférence flux laminaire vertical ).
• Laboratoire en surpression ( avec contrôle de pression des pièces et des sas ).

Pour éviter tout risque d’erreur, les produits venant de couples différents ne doivent pas être traités par la même personne simultanément. Le traitement des gamètes et des embryons de chaque couple doit se faire de manière indépendante sous la hotte à flux laminaire.
Chaque flacon de recueil ( de sperme ou d’ovocytes ), tube ou boite de culture doit porter le nom d’usage du couple ( ou les deux noms s’ils sont différents ), ainsi que les prénoms.
Les embryons doivent être conservés à l’étuve à 37°C, avec 5% de CO2 ( voir chapitre température et air du laboratoire ).

Différents registres biologiques doivent être tenus à jour et conservés au laboratoire d’AMP.
Ces registres doivent permettre d’avoir une traçabilité des actes biologiques effectués en AMP.

Il doit comporter les éléments suivants :

• Nom et prénom des deux membres du couple.
• Age des deux membres du couple
• Technique de préparation du sperme.
• Numération et mobilité des spermatozoïdes avant et après migration.
• Nombre de spermatozoïdes à inséminer.
• Date de l’insémination de sperme.
• Résultat du test de grossesse.

Il doit comporter les éléments suivants :

• Nom et prénom des deux membres du couple.
• Age des deux membres du couple
• Indication de la fécondation in vitro
• Date de la FIV.
• Numéro de la FIV.
• Milieu de culture utilisé.
• Technique de préparation du sperme.
• Numération des spermatozoïdes.
• Mobilité des spermatozoïdes à 24 heures.
• Nombre d’ovocytes recueillis.
• Nombre d’ovocytes inséminés.
• Nombre de zygotes à 2 PN à 18 heures.
• Nombres d’ovocytes à 1 GP non vus fécondés à 18 heures.
• Nombres de zygotes à 3 PN.
• Autres ovocytes.
• Nombre d’embryons obtenus.
• Technique particulière : culture prolongée.
• Date du transfert d’embryons.
• Nombre d’embryons transférés, et stade de ces embryons.
• Nombre d’embryons congelés, et stade de ces embryons.
• Résultat du test de grossesse.
• Résultat de la naissance.

1.8.3 Registre des ICSI

Il est identique au registre des FIV.

Il faut y ajouter :

• Le nombres d’ovocytes à 1 globule polaire.
• Le nombre d’ovocytes injectés.

1.8.4 Registre des embryons congelés

Il doit comporter les éléments suivants :

• Nom et prénom des deux membres du couple.
• Date de la FIV ou de l’ICSI.
• Numéro de la FIV ou de l’ICSI.
• Date de la congélation des embryons.
• Nombre d’embryons congelés.
• Stade des embryons congelés.
• Emplacement de la paillette : numéro du canister où se trouve la paillette.
• Couleur du jonc.
• Date de la congélation des embryons.

Il doit comporter les éléments suivants :

• Nom et prénom des deux membres du couple.
• Date de la FIV ou de l’ICSI.
• Numéro de la FIV ou de l’ICSI.
• Date de la congélation.
• Nombre et stade des embryons congelés.
• Date de la décongélation.
• Nombre d’embryons décongelés.
• Stade des embryons congelés.
• Stade des embryons décongelés.
• Date du transfert d’embryons.
• Stade des embryons transférés.
• Nombre d’embryons restant congelés.

1.8.6 Registre des cultures prolongées.

Il doit comporter les éléments suivants :

• Nom et prénom des deux membres du couple.
• Date de la FIV ou de l’ICSI.
• Numéro de la FIV ou de l’ICSI.
• Nombre d’embryons mis en culture prolongée.
• Nombre de blastocystes obtenus ( à J5, J6 ou J7 ).
• Nombre de blastocystes transférés.
• Date du transfert.
• Nombre de blastocystes congelés.
• Date de la congélation.
• Résultat du test de grossesse.
• Résultat de la naissance.

Ce registre doit comporter :

• L’ensemble des contrats de maintenance de chaque appareil (pour chaque fournisseur).
• Pour chaque appareil, une fiche permettant de noter les interventions effectuées sur l’appareil, avec la date de l’intervention, et le nom de la personne intervenante.

Sur chaque appareil, doit se trouver également une fiche avec :

• La date d’achat de l’appareil.
• La date de la dernière maintenance fournisseur.
• La date de la prochaine maintenance fournisseur
• La date du dernier contrôle assurance qualité ( extérieur )
• La date du prochain contrôle assurance qualité ( extérieur ).

1.8.8 Registre des lots de réactifs.

Ce registre doit comporter pour chaque réactif utilisé en AMP :

• La date de réception.
• Le numéro de lot du réactif.
• La date de péremption.
• La date de première utilisation de ce lot.
• La date de la dernière utilisation de ce lot.

1.8.9 Registre des modes opératoires et des procédures.

Un registre contenant les modes opératoires et les procédures doit être à la disposition des personnes travaillant en AMP.

Ces modes opératoires et procédures sont validés et signés par un responsable du laboratoire. Le numéro de la version doit être précisé. Seule la dernière version validée doit être à la disposition du personnel.

2.1 Locaux d’AMP pour l’activité biologique

Pour un laboratoire d’AMP, la structure suivante est le minimum obligatoire :

• Une pièce exclusivement réservée au recueil du sperme comprenant :
  Un lavabo équipé d’un système de fonctionnement automatique
  Un dispositif permettant d’assurer l’hygiène du recueil
  Un affichage de la procédure de prélèvement.
  Cette pièce doit être isolée (phoniquement), et offrir toutes les garanties de confidentialités.
• Une pièce exclusivement réservée pour le traitement des gamètes.
  Cette pièce doit être équipée d’un sas d’entrée dans le cas où des fécondations in vitro y sont effectuées.
• Une pièce exclusivement réservée à la conservation des gamètes et des embryons congelés.
  Cette pièce doit être équipée d’un système antivol, et d’un dispositif d’extraction de l’azote (avec système de contrôle de la teneur en oxygène de la pièce).
• Un bureau de secrétariat et d’archives.
• Un bureau pour l’entretien du biologiste avec les couples.

L’ensemble des locaux doit être équipé de système de protection contre les effractions et les vols. Ce système doit être en relation avec l’équipe de sécurité de l’hôpital ou un organisme de sécurité extérieur.

Actuellement, les milieux utilisés en AMP ne répondent pas à une définition stricte.
La loi relative au renforcement de la veille sanitaire et du contrôle de la sécurité sanitaire des produits destinés à l’homme (Loi n° 98-535 du 01/07/1998) crée une nouvelle catégorie de produits : les Produits Thérapeutiques Annexes (PTA).
Les PTA sont définis comme tout produit, à l’exception des dispositifs médicaux mentionnés à l’article L665-3 du Code de la Santé Publique, entrant en contact avec des organes, tissus, cellules ou produits issus du corps humain ou d’origine animale au cours de leur conservation, de leur préparation, de leur conditionnement ou de leur transport avant utilisation thérapeutique chez l’homme ainsi que tout produit entrant en contact avec des embryons dans le cadre d’une activité d’AMP.
Les PTA entrent désormais dans le cadre de compétence de l’Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé ( AFSSAPS ).
En l’attente de la parution des Décrets d’application relative à ces produits, les PTA ne font pas l’objet d’une évaluation par l’AFSSAPS, et sont toujours commercialisés sous la seule responsabilité des fabricants.
Une étude est actuellement demandée par l’AFSSAPS pour établir un relevé des PTA actuellement utilisé.
Dans le domaine de l’AMP, sont considérés comme des PTA :

• Les milieux utilisés pour la culture embryonnaire
• Les milieux pour traitement du sperme en vue d’insémination ou de fécondation in vitro.
• Les milieux pour le traitement des ovocytes.
• Les milieux pour la congélation, la décongélation, la conservation des gamètes, et des embryons.
• Tous les additifs qui peuvent être ajoutés extemporanément aux milieux (sérum de veau fœtal, albumine).

D’une manière générale, il est recommandé que l’utilisation de matériaux d’origine animale soit évitée autant que faire se peut.
L’utilisation d’un nouveau milieu d’AMP ne peut se faire qu’avec l’accord de la Commission Nationale de Médecine et de Biologie de la Reproduction et du Diagnostic Prénatal.
Il est nécessaire d’avoir une traçabilité des milieux utilisés au laboratoire d’AMP (voir Registre des Milieux).
Les milieux de culture doivent être conservés au réfrigérateur à +4°C.
Avant toute utilisation les milieux de culture doivent être placés à l’étuve à 37°C, sous 5% CO2.
Les Biologistes des Laboratoires d’Etude de la Fécondation et de la Conservation de l’œuf ont mis en place un outil de vigilance permettant une analyse rapide des données et résultats de leurs pratiques. L’activité BLEFCO Vigilance a développé une base de donnée permettant la saisie et l’analyse d’informations techniques communiquées mensuellement par les laboratoires français. Ces données concernent notamment l’utilisation des milieux d’AMP.

Les tests pratiqués aujourd’hui sur les incubateurs, les hottes, les étuves et dans le laboratoire constatent qu’une contamination de ces enceintes est possible.
Les éléments retrouvés sont des micro organismes, des solvants, des composants organiques volatiles, comme les aldéhydes.

Les études effectuées sur les aldéhydes montrent qu’à partir d’un certain taux, ceux ci ont un effet très néfaste sur le développement des embryons en culture.

Les sources de contamination sont issues des différents matériels utilisés dans, autour, et en dehors de l’environnement du laboratoire.
Les locaux concentrent et retiennent ces différentes impuretés, et actuellement il n’existe aucun moyen de les détruire.
Dans ces conditions, il est important d’empêcher ces impuretés d’entrer dans le laboratoire, et de dégrader les conditions de culture des embryons.
Le laboratoire doit disposer d’un environnement avec :

• Un air climatisé.
• Un air filtré.
• Des pièces de cultures cellulaires en surpression.

L’entrée dans le laboratoire de fécondation in vitro doit se faire par un sas. Cette entrée ne doit être possible qu’aux personnes autorisées.

Un contrôle de la surpression doit être facilement lisible : présence de manomètre de pression à l’intérieur et à l’extérieur du laboratoire.

Les filtres présents au niveau des bouches d’aération doivent être régulièrement contrôlés et changés. L’encrassement des filtres doit être contrôlé en permanence par les indicateurs de pression.
Les dates de vérification et de changement des filtres doivent être consignées dans un registre de maintenance.

Concernant les étuves, il est souhaitable que des filtres soient installés à l’entrée de celle ci.

Les systèmes de filtres type "Gen X" doivent permettre d’avoir à l’intérieur du laboratoire et des étuves un air parfaitement contrôlé, donnant aux embryons les meilleures conditions de culture et de développement.

Les embryons doivent être conservés dans un air à 5% de CO2.
Les 5% de CO2 doivent être donné :

• Soit par l’étuve réglée à 37°C
• Soit directement par un mélange déjà prêt à 5% : dans le cas où l’on devrait travailler sous une cloche à température ambiante (cas de la congélation et de la décongélation)

Le CO2 utilisé doit être un CO2 de grade médical.
Pour éviter une contamination de l’étuve par un air impropre, il est souhaitable de placer à l’entrée de celle ci un système de filtre permettant d’avoir un air très purifié ( voir plus haut ).

La valeur du CO2 de l’étuve doit être affichée et contrôlée :

• Quotidiennement par les techniciens du laboratoire
• Régulièrement par un organisme extérieur.

Il est souhaitable d’avoir :

• Au minimum 2 étuves à CO2 (permettant un dépannage en cas de panne)
• Un système de passage automatique d’une bouteille de CO2 sur la bouteille de réserve.
• Un système d’alarme en cas de diminution de la teneur en CO2 dans l’étuve.

Le changement de bouteille de CO2 doit être prévu régulièrement et anticipé pour éviter toute coupure d’alimentation de l’étuve.
La date des changements doit être notée dans le registre des maintenances.

Il est nécessaire d’avoir au minimum :

• 1 cuve de stockage pour les paillettes de sperme
• 1 cuve de stockage pour les embryons :
  - ces deux cuves doivent être équipées de canister dans lesquels se trouvent des visotubes.
  - les canisters et visotubes doivent être correctement identifiés, et leur emplacement doit être facilement repérable.
• 1 cuve de réserve d’azote liquide avec un dispositif de remplissage des cuves de stockage
• 1 cuve de dépannage à utiliser en cas de problème sur une des deux cuves de stockage.

La cuve de réserve d’azote doit disposer d’un dispositif de branchement sur l’appareil de congélation.
La cuve de réserve doit être régulièrement remplie afin de ne jamais tomber en panne. Un contrat doit être passé avec une société de livraison d’azote liquide. Une traçabilité du remplissage doit être faite afin de connaître la date des livraison, et la personne présente le jour de la livraison.

Les cuves de stockage ( sperme, et embryons ) doivent être :

• Régulièrement contrôlées ( niveau )
• Régulièrement remplies à partir de la cuve de réserve.

Ces deux opérations doivent être tracées. Une fiche doit être placée près des cuves afin d’y noter la date de contrôle ou de remplissage, et la personne qui a effectué l’opération.
Le laboratoire d’AMP doit passer un contrat avec un autre laboratoire conservant du sperme et des embryons congelés afin de transférer les paillettes en cas de nécessité.

Les appareils les plus couramment utilisés sont un congélateur programmable LC40 ou MS21. Avant chaque congélation il faut contrôler le niveau d’azote liquide dans la bonbonne qui alimente l’appareil à l’aide d’une règle en plastique (au moins 30 cm d’azote par congélation).
Les joncs d’identification devront comporter le nom d’usage du couple, prénom de la conjointe et N° de l’embryon.
Le conditionnement comportera dans une paillette toujours un embryon, au maximum deux.
Ces appareils feront l’objet d’une vérification quotidienne et d’un contrat d’entretien systématique avec une firme agrée.

La température doit être parfaitement régulée au laboratoire d’AMP.
En effet, différentes études ont montré que les écarts de température que subissent les embryons peuvent notablement diminuer les résultats obtenus en AMP.
Dans ces conditions, il est nécessaire d’avoir :

• Un laboratoire climatisé.
• Des hottes à flux laminaire totalement thermorégulées ou à défaut des platines chauffantes parfaitement réglées à 37°C.
• Des étuves à 37°C parfaitement bien réglées. La température des étuves doit être contrôlée quotidiennement par le personnel du laboratoire, et régulièrement par un organisme extérieur.

Concernant les étuves, il est souhaitable d’avoir en plus de l’affichage de température de l’étuve, une sonde indépendante permettant le contrôle de la température à l’intérieur de l’étuve.

Il est souhaitable d’avoir plusieurs étuves afin qu’elles ne soient pas ouvertes trop fréquemment pour éviter les écarts de température.

L’ensemble des manipulations des actes biologiques d’AMP doit être réalisé en atmosphère stérile. L’utilisation de hotte à flux laminaire est indispensable.
Il est préférable d’utiliser des hottes à flux laminaire vertical de classe 2, protégeant à la fois les gamètes, les embryons et le manipulateur.
Il est souhaitable que ces hottes soient thermostatées à 37°C, afin d’éviter les écarts de température.

Le consommable utilisé en AMP doit être :

• A usage unique, et stérile.
• Non cytotoxique
• Spécialement conçu pour la culture cellulaire.

La stérilisation ne doit en aucun cas être faite avec de l’oxyde d’éthylène, mais uniquement par stérilisation gamma.

Le sperme doit être émis au laboratoire, après une abstinence de 3 à 4 jours.
Le prélèvement doit suivre une procédure rigoureuse, qui doit être notée dans les salles de prélèvement :

• Uriner
• Lavage du gland et des mains
• Recueil du sperme par masturbation dans un réceptacle stérile.

Cette méthode de prélèvement doit permettre d’éviter les contaminations du sperme.

Dans les cas d’importante oligospermie, il peut être utile d’avoir au laboratoire des paillettes de sperme auto conservé, qui peuvent être décongelés au dernier moment.
Dans les anomalies cytogénétiques explorées par FISH au niveau du sperme, il peut être utile de disposer d’un éjaculat congelé pour lequel le taux d’anomalie est le plus faible.
Des prélèvements de spermatozoïdes peuvent être faits au niveau de l’épididyme, en cas d’azoospermie obstructive.
Les prélèvements testiculaires peuvent être proposés aux patients en cas d’échec de prélèvements épididymaires, ou en cas d’azoospermie non obstructive. Mais les dernières publications semblent montrer un taux d’anomalies plus élevé devant faire discuter très sérieusement cette indication. Ces anomalies pourraient être dues à un défaut d’empreinte génomique au niveau des spermatozoïdes testiculaires.

La qualité ovocytaire dépend entre autre :

• De la réserve ovarienne explorée par le bilan hormonal à J3 : E2, FSH, Inhibine B.
• De la qualité de la réponse ovarienne à la stimulation.

La décision de la ponction se fait sur les critères échographiques ( nombre et taille des follicules ), et hormonaux ( E2, LH ).

La qualité biologique des ovocytes ne peut être que différée en FIV conventionnelle, puisque l’observation des ovocytes est faite à 18 heures post insémination.
En FIV conventionnelle, seule la qualité des cumulus ( aspect, taille ) peut être observée.
En FIV avec micromanipulation, la décoronisation des ovocytes avant micro-injection permet d’observer le nombre d’ovocytes murs ( à 1 globule polaire ). Ce pourcentage d’ovocytes murs est un élément important d’interprétation de la réponse ovarienne à la stimulation.

La qualité embryonnaire est basée sur différentes classifications.
Celle du BLEFCO prend en compte le nombre de cellules embryonnaires, la régularité de ces cellules, et le pourcentage de fragmentation dans l’embryon.
Nomenclature de cette classification : N(X, Y).

• N : nombre de cellules dans l’embryon.
• X = 1 : cellules régulières.
• X = 2 : cellules irrégulières.
• Y = 1 : absence de fragment.
• Y = 2 : taux de fragments < 20%
• Y = 3 : taux de fragments entre 20 et 50%
• Y = 4 : embryon fragmenté.

Mais la qualité embryonnaire peut également se juger sur d’autres critères :

• Régularité des pronuclei observés à 18 heures post insémination.
• Régularité du cytoplasme.
• Cytoplasme granuleux
• Présence de vacuoles (élément défavorable).
• Cinétique de division des cellules : entre J1 et J2, J2 et J3, puis jusqu’au stade blastocyste.

Ce dépistage doit être proposé actuellement à chaque femme enceinte.
Il est effectué en France entre la 14ème et la 17ème semaine d’aménorrhée.
Le test de dépistage est basé sur le dosage de la béta HCG, de l’alpha foetoprotéine, et de l’oestriol.

Le risque statistique est calculé en fonction de la date de la grossesse, de la valeur des hormones citées. Ce calcul est fait par un logiciel qui prend en compte ces différentes données, et donne un résultat en fonction des multiples de la médiane.
Le risque doit être calculé en fonction du nombre de fœtus.

Il est actuellement discuté de l’intérêt d’un dépistage de trisomie 21 par des marqueurs biochimiques au moment du premier trimestre : Protéine PAP A, béta HCG libre.

Les indications de l’amniocentèse en France sont :

• L’âge maternel.
• Les signes échographiques.
• Le risque calculé par le dépistage biochimique.
• Anomalies chromosomiques connues dans la famille.

Les examens cytogénétiques se font sur le liquide amniotique ( dans certains cas sur villosités choriales ou sang de cordon ).

Le caryotype standard est effectué, puis éventuellement devant certains signes cliniques, un caryotype en haute résolution peut être demandé.

Devant certaines anomalies, une analyse plus fine peut être effectuée en cytogénétique moléculaire par différentes techniques ( FISH, CGH …).

Dans certains cas, et pour certaines indications très limitées, un diagnostic pré-implantatoire peut être proposé au couple.
Ce diagnostic ne peut se faire que dans des centres agréés ( 3 Centres en France ).
Le diagnostic pré-implantatoire ne doit pas se substituer au diagnostic pré-natal.

Il est conseillé que les enfants nés des techniques d’AMP soient régulièrement suivis.
L’équipe pluridisciplinaire doit connaître l’évolution de la grossesse, avoir des données sur les conditions de l’accouchement, et sur la santé de l’enfant.
Un suivi régulier pendant les deux premières années de l’enfant doit être ensuite proposé aux parents qui peuvent refuser.
Les équipes d’AMP peuvent se faire assister par une association pour ce suivi.

Les différentes études effectuées jusqu’à aujourd’hui ne semblent par montrer un taux d’anomalie plus important chez les enfants nés des techniques d’AMP ( y compris ICSI ).
Néanmoins les réserves sur la connaissance de ces techniques doivent être présentées au couple, avant toute tentative d’AMP.

Comme dans tous les domaines de la médecine et de la biologie, les procédures de gestions de l’assurance qualité sont de plus en plus présentes, bien définies et rigoureuses, et doivent être mises en place en Assistance Médicale à la Procréation.

Dans ce domaine plus que pour d’autres domaines de la biologie, l’assurance de la qualité de nos actes doit être notre préoccupation quotidienne, chaque ovocyte, et chaque embryon étant unique et ne permettant pas qu’il y ait de "coup d’essais".

Références bibliographiques :