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Comment améliorer l'implantation embryonnaire.

C. Rongieres

Comment améliorer l'implantation embryonnaire.

Dr Catherine Rongières

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QCM PRE TEST :

Sur quels critères juge t on de la qualité embryonnaire à J3 ?

1. Nombre de cellules

2.  % de fragments

3. Régularité des cellules

4. Précocité du clivage

5. Cinétique d’évolution de J2 à J3

 

Dans quelles circonstances les chances d’implantation sont augmentées ?

1.     Muqueuse supérieure ou égale à 10 mm

2.     Transfert d’au moins deux embryons quelque soit l’âge.

3.     Cathéter rigide

4.     Transfert sous échoguidage

5.     Muqueuse triple couche le jour de l’hCG

 

Chez une femme de 25 ans, qui a obtenu 5 embryons à J3, pour lui donner toutes les chances de réussite

1.     vous en transférez deux et en congelez trois

2.     Vous préférez cultiver à blastocyste et transférez un

3.     Vous préférez congeler devant une muqueuse triple couche à 6 mm

4.     Vous effectuez un cathéterisme d’essai avant transfert

5.     Vous choisissez un embryon qui est passé de 5 à 6 cellules de J2 à J3 mais régulier sans fragment plutôt qu’un embryon à 8 cellules mais  régulier avec quelques fragments.

 

Introduction :

On aurait pu imaginer que le transfert d’un embryon dans un utérus préparé permettrait une implantation quasi systématiquement. Malheureusement, il n’en va pas de la sorte, et depuis les débuts de l’AMP, l’amélioration de l’implantation est au centre des recherches. De multiples éléments sont impliqués dans cet événement pivot. La qualité de l’embryon transféré, la qualité de la muqueuse qui l’accueille et la qualité du transfert lui-même, geste assez simple, rapide et pourtant crucial. D’autres éléments en amont ou en aval sont également concernés. Cependant, ce sont ces trois sujets qui seront développés.

La qualité embryonnaire.

Le développement embryonnaire

Quelques données fondamentales

La FIV et l’ICSI sont deux techniques d’assistance médicale à la procréation pour lesquelles la fécondation de l’ovocyte par le spermatozoïde a lieu in vitro et les premières étapes du développement de l’oeuf fécondé au blastocyste peuvent être suivies de visu.

- Entre douze et dix-huit heures après la mise en contact des gamètes, la fécondation se traduit par la présence au sein de l’ovocyte de deux pronuclei ou pronoyaux: le pronoyau mâle et le pronoyau femelle, l’ovocyte fécondé est alors appelé zygote.

Les deux pronoyaux migrent l’un vers l’autre vers le centre de l’oeuf, lorsqu’ils sont au contact l’un de l’autre (caryogamie), les chromosomes s’individualisent, un fuseau de division se met en place, les enveloppes des pronoyaux sont détruites et les chromosomes viennent se placer autour de la plaque équatoriale métaphasique. L’assemblage des matériaux génétiques maternels et paternels marque la fin de la fécondation et le début du développement embryonnaire.

- Le clivage: l’oeuf fécondé se divise par mitoses successives  en cellules dont la taille diminue progressivement: les blastomères. Environ 48 heures après la rencontre des gamètes, l’embryon humain comporte généralement entre 2 et 4 blastomères.

La segmentation ou clivage se poursuit, 72 heures après la mise en contact ovocyte-spermatozoïde, l’embryon présente de 6 à 8 cellules. A partir du stade 4 cellules commence la transcription du génôme embryonnaire.

- Entre le 4ième et le 5ième jour, les blastomères périphériques établissent entre eux des contacts étroits: c’est la compaction et l’embryon est alors appelé morula.

- Entre le 5ième et le 6ième jour se forme le blastocyste: les blastomères les plus périphériques s’aplatissent pour former une couche continue: le trophoblaste ou trophectoderme, une infiltration de liquide provoque la formation d’une cavité: le blastocèle, les blastomères internes sont regroupés en un massif rattaché au trophoblaste: le bouton embryonnaire ou masse cellulaire interne.

Le stade blastocyste est le dernier stade embryonnaire observable in vitro. En effet l’étape suivante s’effectue in utero: c’est l’éclosion du blastocyste de sa zone pellucide et sa nidation dans l’uterus.

Les techniques de FIV et ICSI permettent d’obtenir plusieurs embryons au cours d’un même cycle. Un compromis doit sans cesse être trouvé entre l’optimisation du taux de grossesse initiée par transfert et la minimalisation du taux de grossesse multiple. C’est pourquoi le choix des embryons transférés est très important pour réimplanter le moins d’embryons possible ayant le maximum de chances d’implantation.

L’estimation de la qualité embryonnaire se fait aux différents stades de développement.

Le stade zygote

Evaluation de la qualité

Au stade zygote, les génômes originaires des deux gamètes sont encore physiquement séparés dans leur pronoyaux respectifs. De nombreuses transformations morphologiques interviennent pendant le développement des zygotes humains dont certaines sont visualisables par une simple observation microscopique. Parmi ces transformations, la croissance et la fusion des nucléoles (en fait « nucleolar precursor bodies » (PNB)) présentent une cinétique bien connue qui fait des PNB des candidats idéaux pour une évaluation morphologique de la qualité des zygotes.

Plusieurs types de classification des zygotes ont été proposés (Payne, 1997; Scott, 1998; Tesarik, 1999). La classification de Tesarik semble particulièrement intéressante, elle montre une relation entre le pattern morphologique du zygote, l’arrêt ulterieur de développement de l’embryon et les chances d’implantation de l’embryon.

Une étude préliminaire menée dans notre laboratoire montre que les zygotes classés « normaux » selon les critères de Tesarik ont 3 fois plus de chances de s’implanter après transfert in utero que les zygotes des autres classes.

Stratégies de transfert

Quelques études ont été menées au cours desquelles les embryons étaient replacés au stade de zygote. Le replacement a été fait soit dans la trompe par le pavillon: c’est le ZIFT (Zygote Intra-fallopian Transfer)(Devroey, 1989), méthode justifiée par l’hypothèse que le transfert dans la trompe au stade zygote est plus proche des conditions physiologiques, mais la nécessité d’avoir recours à une coelioscopie pour placer les embryons représentait une contrainte importante qui a amené au quasi abandon de cette technique.

Le replacement a également été réalisé dans l’utérus: c’est le PROST (Pronucleated Stage Transfer). Cette technique n’est plus guère utilisée à l’heure actuelle.

Stades clivés

Evaluation de la qualité

 En ce qui concerne les embryons clivés à 48 heures après la mise en contact des gamètes, l’appréciation de la qualité repose sur une approche morphologique basée sur deux critères: le nombre de blastomères présents (idéalement entre 2 et 4) et la présence de fragments cytoplasmiques.

Plusieurs classifications plus ou moins compliquées ont été proposées; la plus couramment utilisée distingue 5 classes d’embryon (Veeck, 1991):

- classe A ou 1: embryon présentant des blastomères de taille égale, pas de fragments

-classe B ou 2:embryon présentant des blastomères de taille égale, présence d’une quantité peu importante de fragments

- classe C ou 3: embryon présentant des blastomères de taille inégale, peu ou pas de fragments

- classe D ou 4: embryon présentant des blastomères de taille égale ou inégale, présence d’une quantité importante de fragments

- classe E ou 5: embryon présentant peu de blastomères, fragmentation très importante ou complète

Utilisée depuis de nombreuses années, cette classification ne permet qu’une estimation grossière de la qualité embryonnaire: les embryons ayant des blastomères de taille égale et présentant pas ou peu de fragmentation ont plus de chances de s’implanter que les autres types d’embryons !

 En ce qui concerne les embryons clivés à 72 heures après la mise en contact des gamètes, l’appréciation de la qualité repose sur une double approche: à l’appréciation morphologique décrite ci-dessus s’ajoute l’appréciation de la cinétique du développement embryonnaire.

Pour évaluer cette cinétique, les embryons au stade zygote sont cultivés de façon individuelle, identifiés et observés chaque jour. Ainsi la cinétique idéale de développement pour un embryon est de passer du stade 2 pronoyaux à 18 heures, au stade 2 à 4 blastomères à 48 heures et 6 à 8 blastomères à 72 heures. Cette observation répétée permet de repérer les embryons ayant arrêté leur développement et qui ne seront donc pas transférés.

L’addition de ces deux paramètres d’évaluation de la qualité embryonnaire: morphologie plus cinétique, constitue une aide appréciable dans le choix des embryons à transférer et a permis d’améliorer les taux d’implantation embryonnaire (Dawson, 1995)

L’Eclosion embryonnaire assistée (assisted hatching): le phénomène de l’éclosion c’est-à-dire la sortie de l’embryon au stade blastocyste de sa zone pellucide, est tout à fait capital pour qu’il y ait implantation embryonnaire. Plusieurs hypothèses ont été avancées pour tenter d’expliquer les échecs répétés d’implantation pour certains couples en AMP. Une explication pourrait être une anomalie de l’éclosion dûe à un épaississement de la zone pellucide de l’embryon cultivé in vitro.

Pour surmonter cette difficulté une technique dite éclosion assistée a été proposée. Cette technique consiste à créer une brèche dans la zone pellucide de l’embryon de 72 heures, juste avant le transfert in utero pour faciliter l’éclosion ultérieure. La brèche peut être réalisée de plusieurs manières: par micromanipulation (Dokras, 1994), en utilisant de l’acide tyrode (Liu, 1993), par l’action d’un rayon laser (Antinori, 1996) ou par une action enzymatique (Lee, 1997).

Un certain nombre d’études ont montré des résultats contradictoires aussi bien en ce qui concerne les résultats que les indications. Une première étude prospective sur 207 patientes montre que les résultats sont similaires dans les deux groupes dès lors que toutes les patientes sont réunies. Si par contre, on les classe par âge, le hatching serait nuisible chez les femmes de moins de 34 ans avec un taux de grossesse significativement moins bon (15% vs 35 % p< 0.05 Rufas-Sapir et al 2004). Une étude européenne multicentrique a voulu savoir si un traitement antibiotique et immunosuppresseur par corticoïdes améliore les résultats après hatching comparé au hatching sans traitement (Primi et al 2004).

Ce traitement serait intéressant chez des patientes qui ont eu des échecs répétés de grossesses après transfert de bonnes qualités (1.6 % des hatching et placebo versus 10.7 % des hatching et traitement vs 17.1 % des contrôles). Enfin, une recherche sur l’intérêt d’affiner la membrane pellucide à l’aide du laser afin de faciliter l’éclosion avant l’ICSI. Ils ont comparé la méthode classique de l’ICSI à ce qu’ils appellent l’ICSI modifié par laser assisté. Sur cent cycles et 1016 ovocytes meta II et en  randomisant les ovocytes d’une même patiente  (Moser et al 2004). Ils ont trouvé un taux de dégénérescence moins important dans le groupe avec laser alors que les taux de fécondation et d’évolution embryonnaire étaient les mêmes.

En transférant soit deux embryons appartenant à la cohorte étudiée, soit un embryon de chaque groupe (mixte) soit deux embryons contrôles, les taux de grossesses cliniques et d’implantation  à J3 sont supérieurs dans le groupe avec laser seul ou mixte (47.4 % et 27. 3% laser et 33.3% et 17.5% mixte versus 8.3% et 9.1 % contrôle (P < 0.039 ). Les taux de grossesses et d’implantation ne sont pas significativement différents dans la globalité des transferts (J3 et J5) avec cependant une tendance (42.4% et 30.7% laser et 41.3% et 21.3 % mixte versus 23.8% et 19.6% contrôle) probablement lié au nombre de l’effectif .   

De très nombreuses études ont été réalisées pour tester l’éclosion embryonnaire assistée par ces différentes méthodes. Les résultats sont discutables et divergent d’une étude à l’autre. La récente mise au point faite par la Cochrane Database en 2009 met en évidence une légère augmentation des taux de grossesses mais considère les les résultats insuffisants pour pouvoir dire si le hatching a véritablement un intérêt.

Stade blastocyste

L’embryon clivé placé dans un milieu approprié peut poursuivre son développement jusqu’au stade de blastocyste caractérisé par la présence d’une cavité centrale, d’un bouton embryonnaire et d’une couronne de cellules périphériques.

Evaluation de la qualité

En fonction de l’aspect morphologique des différents éléments du blastocyste: taille de la cavité, nombre de cellules constituant le bouton embryonnaire, aspect festonné ou non des cellules périphériques; plusieurs classifications des blastocyste ont été proposé (LA da Motta, 1998). Le blastocyste idéal doit présenter une vaste cavité occupant plus de 50% du volume embryonnaire, les cellules périphériques doivent être aplaties et festonnées, le bouton embryonnaire doit être bien compact et présenter un nombre suffisant de cellules; enfin la zone pellucide doit être amincie et la taille globale de l’embryon augmentée.

Mode d’obtention du blastocyste

Depuis le début des années 1990 différents sytèmes de culture ont été proposés pour le développement de l’embryon humain jusqu’au stade blastocyste. Les premiers succès ont été obtenus en utilisant des systèmes de coculture au cours desquels les embryons humains étaient cultivés sur un tapis de cellules, ces cellules pouvant être d’origine variables (Ménézo, 1992). Ceci indique l’adaptabilité de l’embryon humain à différentes conditions de culture. Mais malgré un bel aspect morphologique, les blastocystes ne sont pas égaux en capacité d’implantation selon les conditions de culture, d’où les résultats très variables observés dans les très nombreuses publications consacrées à ce sujet.

Historiquement, les recherches sur l’embryon de mammifères in vitro, ont montré que les conditions de culture qui favorisaient le clivage embryonnaire n’autorisaient pas le developpement du blastocyste et vice versa. La  mise au point de milieux séquentiels acellulaires plus sûrs que les cocultures, a généré de grands espoirs qui pour l’instant ne se sont pas encore concrètisés (pour une revue complète: Blastocyst stage transfer: pittfalls and benefit: Tsirigotis, Gardner, Desai, Quinn, 1998).

Intérêts et limites du transfert de blastocystes

Théoriquement le transfert d’embryons au stade blastocyste présente plusieurs avantages:

- éviter la présence prématurée d’embryons clivés dans la cavité utérine qui aurait des effets négatifs sur l’implantation

- obtenir une meilleur synchronisation entre l’état de réceptivité de la muqueuse utérine et le stade embryonnaire (fenêtre d’implantation)

- diminuer le taux de grossesses multiples en AMP en diminuant le nombre d’embryons transférés

- sélectionner les embryons aptes à poursiuvre leur développement jusqu’au stade blastocyste.

Le transfert d’embryons humains au stade blastocystes n’est ni un concept ni une technique nouvelle. Réalisé par plusieurs équipes en routine par coculture depuis 1992, de bons résultats ont été obtenus en particulier chez des patientes dites mauvaises implanteuses, mais sans que l’on sache si le succès était dû à une meilleure sélection embryonnaire ou un meilleur développement du fait de facteurs produits par les cellules co-cultivées ou du fait d’une meilleure synchronisation utérus/embryon.

Le système des co-cultures en particulier hétérologue a été quasiment abandonné au profit des milieux séquentiels.

Cependant le transfert de blastocyste a aussi montré ses limites: la plus importante étant le taux réduit d’embryons clivés atteignant le stade blastocyste (40 à 50% maximum) ce qui représente une perte importante d’embryons pour les couples.

Papanicolaou et al en 2008 sur une méta analyse montre qu’il existe un meilleur taux de grossesses quand on transfère à J5 comparé au transfert de J3 si le nombre d’embryons transférés est équivalent.  La Cochrane data base en 2007 avait montré une amélioration des taux de grossesses au stade blastocyste avec effectivement un taux significativement plus élevé d’annulation en J5 pour arrêt de développement embryonnaire.

Une récente étude nantaise, a établi un modèle permettant de prédire la réduction du risque d’absence d’évolution de J3 à J5 en prenant en compte et de façon indépendante, l’âge de la patiente , le aux de fécondation, le nombre d’embryons à 6-8 cellules à J3. A creuser si l’on veut pouvoir améliorer les chances d’implantation par le biais de la culture prolongée sans risquer d’annuler le cycle.

Préparation de l’endomètre

Qu’attend-on de l’endomètre au cours d’une stimulation de l’ovulation ?

L’épaisseur endométriale semble être un critère nécessaire, certes pas suffisant pour juger de la capacité d’implantation d’un embryon. Une épaisseur au moins égale à 7 mm devrait être exigée au moment du déclenchement (Al Ghamdi 2008). De Geyter et al sur une étude de 1186 femmes infertiles, comparent l’épaisseur de la muqueuse utérine en fonction de la réussite ou non du traitement (IIU ou FIV/ICSI). Les courbes sont strictement superposables avec une épaisseur moyenne de la muqueuse au  moment du déclenchement de l’ovulation autour de 10 mm. Quand ils regardent les taux de grossesses en fonction de  l’épaisseur endométriale, il ne semble pas que le degré d’épaisseur endométriale influence les résultats et cela quelque soit le traitement. En stratifiant les patientes par rapport à leur épaisseur endométriale, ils  retrouvent   des taux bas seulement pour des muqueuses très fines en IIU ou dans des protocoles courts en FIV.

L’obtention de grossesses  avec des muqueuses inférieures à 7 mm voire à 4 mm ne les incitent pas à recommander une annulation des cycles ou une congélation des embryons dans le but d’obtenir sur un autre cycle une muqueuse de meilleure qualité. Il est à noter qu’ils ont peu de patientes avec une muqueuse < 8 mm (161 patientes < 8 mm contre 1414 patientes > 8 mm). A contrario, ils observent aussi moins de grossesses pour des patientes aux muqueuse > 11 mm, comme c’est classiquement décrit dans la littérature. Tsai et al sur 110 couples en IIU et Sharara et al sur 103 cycles en FIV concluent que l’épaisseur endométriale n’est pas prédictive de la réussite d’un cycle. Par contre, l’aspect endométrial est prédictif de l’obtention d’une grossesse et de façon significative chez Sharara.

Donc, plus que l’épaisseur, l’aspect de l’endomètre paraît intéressant. La description de la transformation de  l’endomètre au cours de la stimulation de l’ovulation (Gonen et al 1990, Bustillo et al 1995, Delti 2008)  définit l’aspect en triple couche (ou grain de café) idéal au moment du déclenchement. Un aspect hyperéchogène au moment du déclenchement serait péjoratif. Les nombreuses études qui s’en sont suivies retrouvent à peu près ces résultats. Fanchin et al ont été plus loin, en montrant sur 121 femmes traitées que la précocité de l’échogénicité de l’endomètre est délétère et diminue considérablement les taux de grossesses. L’étude de l’échogénicité était faite de façon objective par un système de digitalisation de l’image et du calcul des gris sur la plus épaisse surface de l’endomètre. Il ne s’agit donc pas comme la plupart des études de  cotation à l’œil nu. 

 Six groupes ont été ainsi définis (£ 30% d’hyperéchogénicité, 31%-40%, 41-50%, 51-60%, 61-70% et > 70%). L’épaisseur endométriale dans les six groupes n’étaient pas significativement différente (10.0 ± 0.1 mm). Les taux de grossesses cliniques sont respectivement de 59%, 57%, 35%, 20%, 16% et 11%  (p<0.001). Les auteurs concluent que la précocité de différentiation de l’endomètre est délétère pour l’implantation.  Ils préconisent soit une congélation des embryons dans ce cas, pour un transfert au cours d’un cycle mieux préparé soit un traitement en fin de phase folliculaire par un antiprogestatif afin de retarder la transformation endométriale sous l’action de la progestérone.

Il existerait une croissance propre à chaque patiente qui se révèlerait de traitement en traitement (Scioscia 2009) ; c’est probablement par ces facteurs intrinsèques qu’une amélioration individuelle de la préparation utérine serait envisageable. Quand bien même, une belle muqueuse est nécessaire mais non suffisante à l’implantation et des facteurs locaux sont en jeu (cytokines, facteurs de croissance…). Dans le cadre des transferts des embryons congelés, les traitements substitutifs s’avèrent être efficace. A l’instar du don d’ovocytes, la préparation par estrogène naturel per os et progestérone micronisée est simple d’utilisation et permet des résultats en terme de taux de grossesses excellent. L’apport d’agoniste  du GnRH chez des patientes qui ont encore des cycles, semblait être un atout majeur dans l’amélioration des résultats en   évitant  des lutéinisations prématurées (El .Thouky 2004)  sur un étude randomisée. Dessolle et al en 2009 sur une étude rétrospective ne retrouve pas d’avantage à l’ajout des agnistes de la GnRH. Dans la Cochrane database de 2008 (Ghobara et al) comparant le cycle substitué, le cycle naturel et le cycle stimulé, les auteurs ne retrouvent pas de réelles améliorations et que les études sont insuffisantes pour  conclure.

Qualité du transfert

Le soin apporté à la qualité du transfert joue un rôle important dans l’augmentation des taux de grossesse en AMP et depuis peu retrouve une place qui avait été négligée jusque-là. Cette qualité tient compte à la fois de l’expérience de l’expérimentateur (Dessolle 2009),  du degré de difficulté du passage du col utérin, du lieu et du temps mis pour le transfert des embryons. Le choix du cathéter et en particulier d’un cathéter souple améliore également les résultats en évitant de blesser la muqueuse utérine, mais on peut discuter ce concept dès lors que l’on transfère sous écho (Aboulfotouh 2008) . La présence de sang sur le cathéter, dehors ou dedans, diminue les taux de grossesse. Il est difficile de savoir si ce sang vient du col ou de l’endomètre, et les traumatismes du col sont les plus communs. Le transfert embryonnaire sous échographie avec une vessie semi pleine  permettrait selon de multiples études d’améliorer les taux de grossesse en favorisant un passage du col facilité par le trajet visualisé (Abou Setta 2007).

 L’importance de la profondeur du replacement des embryons a été étudiée par une équipe espagnole sur une étude prospective randomisée. Les taux d’implantation étaient supérieurs quand le transfert s’effectue entre au moins 10 mm du fond et pas plus de 20 mm Ces résultats confortent le fait que la visualisation de l’arrivée du cathéter dans l’utérus, ainsi que la maîtrise de la profondeur du dépôt des embryons améliorent les résultats. (Tiras 2009)  

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 QCM POST TEST :

Sur quels critères juge t on de la qualité embryonnaire à J3 ?

1. Nombre de cellules

2.  % de fragments

3. Régularité des cellules

4. Précocité du clivage

5. Cinétique d’évolution de J2 à J3

Réponses : 1,2,3,4,5

 

Dans quelles circonstances les chances d’implantation sont augmentées ?

6.     Muqueuse supérieure ou égale à 10 mm

7.     Transfert d’au moins deux embryons quelque soit l’âge.

8.     Cathéter rigide

9.     Transfert sous échoguidage

10.  Muqueuse triple couche le jour de l’hCG

Réponses : 1, 4, 5

 

Chez une femme de 25 ans, qui a obtenu 5 embryons à J3, pour lui donner toutes les chances de réussite

6.     vous en transférez deux et en congelez trois

7.     Vous préférez cultiver à blastocyste et transférez un

8.     Vous préférez congeler devant une muqueuse triple couche à 6 mm

9.     Vous effectuez un cathéterisme d’essai avant transfert

10.  Vous choisissez un embryon qui est passé de 5 à 6 cellules de J2 à J3 mais régulier sans fragment plutôt qu’un embryon à 8 cellules mais  régulier avec quelques fragments.

Réponses : 2   

 

Dr Catherine Rongières